S2、采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入细胞
培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，每隔2天，补加含IL‑2的GT‑T551培养
2.根据权利要求1所述高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，S1的NK细胞培养
基中，黄芩素、姜黄素、云芝多糖的质量比为12‑18：13‑17：18‑22。
3.根据权利要求1所述高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，S1的NK细胞培养
4.根据权利要求1所述高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，S1的NK细胞培养
5.根据权利要求1所述高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，S1的NK细胞培养
6.根据权利要求1所述高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，S1的NK细胞培养
7.根据权利要求1所述高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，S2中，细胞培养
8.根据权利要求1所述高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，S2中，孵育过程
9.根据权利要求1所述高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，S2的含IL‑2GT‑
本发明涉及NK细胞体外扩增技术领域，尤其涉及一种高纯度NK细胞体外扩增培养
关注点。肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法，其中自体免疫细胞(T细
胞、NK细胞)治疗技术属国家卫生部首批允许临床应用的第三类医疗技术。近年来，自然杀
伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌
(3)NK细胞表面表达的CD16分子与肿瘤特异性IgG抗体发生结合，从而识别、杀伤
(4)TNF‑α、IFN‑γ等与靶细胞表面相应受体的结合，启动靶细胞的凋亡系统。
目前一般采用滋养细胞系方法(如使用K562细胞本身作为滋养细胞系)来扩增培
养NK细胞，该方法得到NK细胞纯度较高，但由于K562本身就是肿瘤细胞，生产过程中存在安
因此，目前研发一种纯度高、扩增倍数高、细胞活率高的NK细胞扩增方法，对于NK
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高纯度NK细胞体
S2、采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入
细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，每隔2天，补加含IL‑2的GT‑T551培
优选地，S1的NK细胞培养基中，黄芩素、姜黄素、云芝多糖的质量比为12‑18：13‑
(1)本发明可有效避免动物血清中不确定成分或诱导的肿瘤细胞对细胞培养造成
姜黄素、云芝多糖配合，不仅可促使NK血细胞表面生长因子的释放，激活NK细胞，促使NK细
胞增殖，而且黄芩素、姜黄素、云芝多糖复配可有效抑制T细胞的生长，使所得NK细胞的纯度
(3)本发明方法能使NK细胞体外扩增1600倍以上，而且纯度超过92％。
图2为实施例5扩增方法培养14天的NK细胞稀释160倍后的照片及分析结果图。
S2、采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入
到用CD3抗体与CD56抗体包被的细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，孵
育过程中采用1次/min的速度振摇，每隔2天，补加含500μg/mL IL‑2的GT‑T551培养基，培养
S2、采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入
到用CD3抗体与CD56抗体包被的细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，孵
育过程中采用5次/min的速度振摇，每隔2天，补加含600μg/mL IL‑2的GT‑T551培养基，培养
S2、采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入
到用CD3抗体与CD56抗体包被的细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，孵
育过程中采用4次/min的速度振摇，每隔2天，补加含530μg/mL IL‑2的GT‑T551培养基，培养
S2、采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入
到用CD3抗体与CD56抗体包被的细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，孵
育过程中采用2次/min的速度振摇，每隔2天，补加含560μg/mL IL‑2的GT‑T551培养基，培养
S2、采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入
到用CD3抗体与CD56抗体包被的细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，孵
育过程中采用3次/min的速度振摇，每隔2天，补加含550μg/mL IL‑2的GT‑星空体育 星空体育平台T551培养基，培养
S2、采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入
到用CD3抗体与CD56抗体包被的细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，孵
育过程中采用3次/min的速度振摇，每隔2天，补加含550μg/mL IL‑2的GT‑T551培养基，培养
采用实施例5和对比例的方法扩增NK细胞，配制0.4％台盼蓝溶液，调节其pH值至
7.0～7.2，取第14天培养的细胞。取50μLNK细胞悬液，加入50μL台盼蓝混合，细胞染色4min，
如图1所示，采用实施例5的方法能大幅提高NK细胞的扩增倍数。这是由于向GT‑
T551基础培养基中加入IL‑2、IL‑12、IL‑15、IL‑17与黄芩素、姜黄素、云芝多糖配合，不仅可
促使NK血细胞表面生长因子的释放，激活NK细胞，使NK细胞体外扩增1600倍以上。采用实施
例5扩增方法培养14天，将所收集的NK细胞稀释160倍后进行拍照、分析，如图2所示。
分别取实施例5和对比例方法培养的NK细胞，采用流式检测仪进行细胞纯度检测，
(3)洗细胞去除游离的荧光抗体；加入FACS缓冲液350μL，轻轻混匀，于3000r/min
(4)上样前处理：取100μL仪器缓冲液加入步骤(3)获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬
结果如图3和图4所示，采用实施例5方法扩增的NK细胞纯度远高于对比例。本发明
通过向GT‑T551基础培养基中加入黄芩素、姜黄素、云芝多糖复配可有效抑制T细胞的生长，
采用96孔平底培养板，设实验孔、单纯效应细胞孔、单纯靶细胞孔各3个，并设空白
孔。于实验孔及单纯靶细胞孔，加入K562。在实验孔及单纯效应细胞孔中分别加入实施例1
和对比例培养14天的NK细胞，效靶比设为1：1、1：10、1：20和1：50四组，培养24h。加入20μ
杀伤活性(％)＝[1‑(实验组OD值‑单纯效应细胞组OD值)×单纯靶细胞OD值]×
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其