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NK细胞体外扩增培养基组合和培养方法与流程
发布:2025-07-21 18:25:49 浏览:

  :自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)是机体重要的免疫细胞,主要分布于外周血中,能够参与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节的生理过程。现有研究表明,NK细胞是人体内抗癌活性最强的细胞,可以释放穿孔素在靶细胞表面形成穿孔,再通过颗粒酶进入靶细胞诱导靶细胞凋亡,同时可以分泌大量的细胞因子作用于靶细胞,还可以通过进一步激活其他种类免疫细胞攻击靶细胞,并可以表达诱导细胞凋亡的蛋白和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,使靶细胞发生程序性凋亡。NK细胞免疫治疗在临床上已成为一种重要的治疗手段。但是其在外周血中的数量仅占淋巴细胞总量的5%左右,如何实现NK细胞体外扩增培养从而应用于治疗是关键的技术问题。现有的NK细胞体外扩增手段主要包括在培养基中添加动物血清、细胞因子或与其它细胞共同培养来刺激NK细胞的生长。但是动物血清成分较复杂,易给细胞培养带来不安全因素;细胞因子的添加不当容易引起NK细胞激活受体和抑制受体表达变化;同时,异体的细胞也往往存在医学上的不安全性和伦理问题。因此,有必要开发一种高效、安全的NK细胞体外扩增方法从而为NK细胞的临床治疗应用提供有力的技术保障。技术实现要素:本公开的目的是提供一种NK细胞体外扩增培养基组合及体外扩增方法。为了实现上述目的,本公开提供一种NK细胞体外扩增培养基组合,包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基;其中,所述基础培养基的组成成分包括:RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、庆大霉素和BSA;所述诱导培养基的组成成分包括:RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇;所述增殖培养基的组成成分包括:RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA和细胞介素;所述活化适应培养基包括:RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。可选地,所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的至少一种。可选地,所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。可选地,所述基础培养基包括以下含量的各组分:庆大霉素50-90IU/mL、BSA100-300μg/mL、RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1:0.8-1.2。可选地,所述诱导培养基包括以下含量的各组分:BSA100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、灵芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL,RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1:1-1.4。可选地,所述增殖培养基包括以下含量的各组分:BSA100-300μg/mL、IL-125-15ng/mL、IL-155-15ng/mL、IL-185-15ng/mL和IL-215-15ng/mL,RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1:1.2-1.6。可选地,所述活化适应培养基包括以下含量的各组分:胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM,RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1:2-4。本公开的第二个方面还提供了一种NK细胞体外扩增培养方法,包括使用本公开的第一个方面所述的NK细胞体外扩增培养基组合,所述方法包括:基础培养:将分离的单个核细胞接种于基础培养基中培养1-2天获得基础培养细胞;诱导培养:将所述基础培养细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞;增殖培养:将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养4-7天获得增殖培养细胞;活化适应:将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天。可选地,所述接种的细胞密度为4.5×105个/mL-5.5×105个/mL。可选地,所述基础培养阶段、诱导培养阶段、增殖培养阶段和活化适应阶段在免疫细胞体外扩增装置中进行,所述装置包括细胞培养袋1和承载所述细胞培养袋1的承载台3,该装置还包括容纳于所述细胞培养袋1中的磁性浮球2以及在悬挂于所述细胞培养袋1上方并且能够驱动所述磁性浮球2在所述细胞培养袋1中移动的磁性悬挂驱动器4,所述磁性悬挂驱动器4包括能够吸引所述磁性浮球2的磁体片41和能够悬挂且驱动所述磁体片41在所述细胞培养袋1上方移动的悬挂驱动架42;所述细胞培养袋(1)中充有细胞培养液,述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞;所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上;所述磁体片(41)能够在所述细胞培养袋(1)上方往复移动,从而通过磁力的作用,驱动所述磁性浮球(2)在漂浮状态下在培养液液面往复移动,所述磁性浮球(2)在培养液液面以下的部分能够搅拌培养液,从而在所述细胞培养袋(1)中模拟血液流动的体内环境。通过上述技术方案,本公开所提供的NK细胞体外扩增培养基能够避免动物血清成分和异体细胞的添加,增加了细胞在临床应用中的安全性。而且采用含有不同组分的培养基在细胞生产的特定阶段进行有针对性的培养,可以更好的满足NK细胞在不同阶段的生长需求,更有效的扩增和活化NK细胞,培养获得的NK细胞数量更多在临床治疗中也具有更高的活性。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明,附图说明附图是用来提供对本公开的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本公开,但并不构成对本公开的限制。在附图中:图1是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的切向示意图。图2是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的俯视示意图。图3是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的部件示意图。图4是实施例和对比例NK细胞扩增倍数结果示意图。图5是实施例和对比例培养的NK细胞纯度示意图。图6是实施例和对比例培养的NK细胞杀伤率结果示意图。附图标记说明1细胞培养袋2磁性浮球3承载台4磁性悬挂驱动器11进气口12出气口13进液口14出液口15人工瓣膜片31恒温托盘32底座41磁体片42悬挂驱动架43悬臂431限位孔432驱动孔4310限位杆4311支撑架4320丝杆4321电动机具体实施方式以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开,并不用于限制本公开。本公开的第一个方面提供了一种NK细胞体外扩增培养基组合,包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培星空体育 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基对分离的单个核细胞进行重悬,调整细胞密度至5×105个/mL,在本公开所述的免疫细胞体外扩增装置中进行细胞培养,首先在5%CO2,37℃的环境下进行基础培养1.5天获得基础培养细胞。将细胞离心收集起来,调整细胞密度至5×105个/mL,在5%CO2,37℃的环境下进行诱导培养3天获得诱导培养细胞。将细胞离心收集起来,调整细胞密度至5×105个/mL,在5%CO2,37℃的环境下进行增殖培养6天(每两天传代换液一次)获得增殖培养细胞。将细胞离心收集起来,调整细胞密度至5×105个/mL,在5%CO2,37℃的环境下,进行活化适应培养1天后收集活化后细胞并计数B,计算细胞的扩增倍数用B除以A获得的数值即为细胞的扩增倍数。将所述活化后细胞用PBS洗涤两次,然后调整细胞密度后用流式细胞仪检测NK细胞占总细胞的百分数,为细胞纯度结果。结果如表5和图4-5所示。以对数生长期的A549细胞作为靶细胞,以所述活化后细胞作为效应细胞,按照1:1、10:1、20:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合,同时设效应细胞孔、靶细胞孔,每组均设3个平行孔,每孔终体积为200μl,37℃、5%,CO2培养箱中孵育,12h后每孔加入20μlCCK-8溶液,继续孵育4h,用酶标仪检测450nm时的OD值,计算NK细胞的杀伤率。结果如表6和图6所示。本实施例中进行细胞培养的装置为免疫细胞体外扩增装置,所述装置包括细胞培养袋1和承载所述细胞培养袋1的承载台3,该装置还包括容纳于所述细胞培养袋1中的磁性浮球2以及在悬挂于所述细胞培养袋1上方并且能够驱动所述磁性浮球2在所述细胞培养袋1中移动的磁性悬挂驱动器4,所述磁性悬挂驱动器4包括能够吸引所述磁性浮球2的磁体片41和能够悬挂且驱动所述磁体片41在所述细胞培养袋1上方移动的悬挂驱动架42。所述悬挂驱动架42包括固定连接在所述磁体片41上的悬臂43;所述悬臂43上开设有一个限位孔431和一个设置有内螺纹的驱动孔432;所述悬挂驱动架42还包括二个支撑架4311以及限位连接在所述支撑架4311上的限位杆4310和丝杆4320;所述限位杆4310可滑动地穿过所述限位孔431;所述丝杆4320上设置有与所述驱动孔432的内螺纹匹配的外螺纹并螺旋穿过所述驱动孔432,且所述丝杆4320能够通过绕轴线进行轴向转动。所述细胞培养袋1上开设有可封闭的进气口11、出气口12、进液口13和出液口14。所述出气口12和所述出液口14上设置有能够阻止细胞通过的筛网。所述细胞培养袋1的内部还设置有模拟血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述承载台3包星空体育 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