1.本发明专利涉及细胞生物学和组织工程技术领域，具体涉及一种提高人原代表皮角质细胞体外扩增效率的方法及其在构建三维重组人体皮肤模型中的应用。
2.近年来三维重组人体皮肤模型在皮肤病研究、皮肤创面修复、皮肤药物开发、皮肤美容产品安全性和功效性评估等领域的作用日益受到关注。
3.三维重组人体皮肤模型是通过细胞体外扩增培养技术，得到足够数量的人原代皮肤种子细胞，将其接种于三维组织培养容器内，并通过特定的诱导培养条件使其生长分化为高度模拟人体皮肤、具有完整三维解剖结构的活性皮肤组织模型。现已验证的皮肤模型在基因表达、组织结构，细胞因子、组织活力等方面与人体皮肤都具有高度一致性。
4.皮肤模型最关键的种子细胞主要是表皮角质细胞和真皮成纤维细胞。真皮成纤维细胞具有较强的分裂增殖能力，适应性强，在体外能够传代培养50多代，细胞性状也不会发生明显的退化。而表皮角质细胞的增殖潜力很有限，通常在体外扩增传代5
8代之后细胞就走向终末分化，达到生长极限，因此细胞的群体倍增数仅为15
50倍，难以满足三维皮肤模型批量化构建对种子细胞在数量上的要求，因此探索提高人表皮角质细胞体外扩增效率的方法一直是皮肤生物学研究和皮肤组织工程领域的重要难题。
5.在现有的技术中，提高人原代表皮角质细胞体外扩增效率的方法主要分为两个大类：一类是采用滋养层培养法(rheinwald and green，1975)，另一类是通过优化角质细胞培养基配方来促进细胞的增殖。
60倍，但缺点是引入了其它动物来源的杂质细胞，以这种方法获得的种子细胞不适用于以皮肤创面修复、皮肤病研究为目的的皮肤模型构建。
7.角质细胞的体外扩增效率和培养基配方高度相关，因此优化培养基配方是提高角质细胞产率的重要考察方向。在不采用滋养层细胞的角质细胞培养体系中，大多数公司采购商业化无血清培养基进行角质细胞的培养，主要的品牌包括gibco(美国thermo公司)、lonza(瑞士lonza公司)、promocell(德国promocell公司)以及cellntec(瑞士cellntec公司)。这些商业化培养基的配方是不公开的，因此对于研究人员来说这些培养基中的成分信息不能完全明确，较难根据自身的实际研究需求来调整培养基配方，在表皮角质细胞培养碰到问题时只能简单通过购买和比较不同品牌商业化培养基来进行优化。而皮肤模型的构建对角质细胞的数量质量均有很高的要求，且需要达到稳定的质控目的，因此较为成熟的皮肤模型生产商都会开发适合自己实验室生产要求的角质细胞培养基配方，根据已公开的信息，这些无血清培养基需要添加bpe，bpe是用牛脑垂体制备的提取物，为混合物形式，因此成分依然不明确。
8.为了克服现有技术中没有较好的细胞培养基添加剂，无法适用于多种细胞培养基以及培养的细胞数量质量难以令人满意的问题，本发明的目的在于提供一种细胞培养基添加剂、细胞培养基及细胞体外扩增的方法，通过改进细胞培养基添加剂的组分，使得添加进该细胞培养基添加剂的细胞培养基可以培养获得质量高、数量密度佳的细胞，由此提高人原代表皮角质细胞体外扩增效率，且所得到的细胞能支持构建结构和功能完好的三维重组人体皮肤模型。
10.第一方面，本发明提出了一种细胞培养基添加剂，所述细胞培养基添加剂包括：
12.在本发明所述的技术方案中，通过优化细胞培养基添加剂的配方，以达到促进角质细胞增殖、延长角质细胞体外培养周期的效果，进而实现了人表皮角质细胞体外扩增效率的方法。
13.而原代表皮角质细胞的培养条件复杂，细胞生长条件和常见的细胞系有明显不同，如对生长因子、钙离子等添加剂的要求，需要预防出现提前分化从而抑制生长扩增等现象，因此，如何筛选符合原代角质细胞生长的添加剂，具有一定难度。
14.在本发明中，通过广泛搜索文献资料和细胞培养实验摸索，在基础培养基，例如mcdb153基础培养基配方的基础上，添加本发明所述的细胞培养基添加剂作为组合添加剂(例如具体组分为：20mg/ml人血清白蛋白、2.5ng/ml egf、10ng/ml kgf、10ng/ml fgf
10、0.4μg/ml氢化可的松、5μg/ml胰岛素以及5μg/ml转铁蛋白)，能够大大提高表皮角质细胞的扩增效率，且细胞保持良好的形态。
15.当然，在一些其他商业化原代角质细胞基础培养基(如gibco品牌的epilife，promocell品牌的keratinocyte basal medium 2)为基础，添加本发明所述的细胞培养基添加剂同样能够提高表皮角质细胞的扩增效率，且细胞保持良好的形态。
16.本发明所述的技术方案可实现培养基成分明确可控，且不依赖饲养层、血清和bpe，收获的角质细胞形态状态良好，应用于体外重建皮肤模型时能得到结构和功能完好的三维重组人体皮肤模型。
17.需要指出的是，在现有技术中所存在优化的无血清培养基，其主要改进在于对egf替换为kgf，且是针对从新生小鼠皮肤中分离的角质细胞而开发的，并不能简单套用到人源的表皮角质细胞上；而且只能应用于传代细胞，不适用于原代细胞，因此应用具有局限性。
18.另外，在现有技术中还存在利用衰老细胞或细胞产物作为组合物成分来治疗皮肤伤口的临床疗法，该种技术手段主旨在于期望达到的是诱导细胞衰老的目的。
19.但是与该种技术手段不同的是，本发明所述的技术方案主旨在于使得表皮角质细胞保持活力和功能，使其能应用于各种细胞模型或者皮肤组织模型，基于该种目的，本案发明人调整了细胞培养基添加剂的各项组分，以期获得的细胞形态状态良好的角质细胞。
20.另外，本发明所述的细胞培养基添加剂不含其它动物源成分，且其实用范围广泛，例如可以和epilife、keratinocyte basal medium 2以及mcdb153等多种基础培养基结合使用，更适用于针对人体表皮角质细胞的研究、以及针对人体皮肤的临床应用。
26.更优选地，所述细胞培养基添加剂包括：20mg/ml人血清白蛋白、2.5ng/ml egf、10ng/ml kgf、10ng/ml fgf
10、0.4μg/ml氢化可的松、5μg/ml胰岛素以及5μg/ml转铁蛋白。
27.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
28.第二方面，本发明提出了一种上述的细胞培养基添加剂在细胞培养中的应用；
31.需要说明的是，在本发明所述的技术方案中，优选地适用于人源角质细胞。
32.更优选地，是指是区别于一些无限增殖的角质细胞系(例如hacat细胞系)的原代表皮角质细胞，涵盖了从体外培养新分离的p0代细胞到更高代次的传代细胞。
36.优选地，所述基础培养基选自下述的一种或多种：epilife、keratinocyte basal medium 2以及mcdb153。
40.第五方面，本发明还公开了一种细胞体外扩增的方法，所述方法包括如下步骤：
41.制备培养基：将上述的细胞培养基添加剂加入基础培养基中，获得细胞培养基；
44.步骤s1：构建线：构建表皮层，其中，表皮层中的角质细胞通过所述接种与培养的步骤获得；
48.在所述步骤s1中，体外复苏人真皮成纤维细胞并扩增，并与大分子胶原溶液混合培养例如3
7天，构建成线中，将所述角质细胞接种至步骤s1所获得的真皮层上，构建表皮层；
51.上述技术方案中，大分子胶原溶液可以采用市售试剂，浓度不低于4mg/ml；例如市售的生医级大分子i型胶原蛋白，购自sigma公司。
54.(1)在本发明所述的技术方案中，通过优化细胞培养基添加剂的配方，以达到促进角质细胞增殖、延长角质细胞体外培养周期的效果，进而实现了人表皮角质细胞体外扩增效率的方法。
55.(2)将细胞培养基中添加入本发明所述的细胞培养基添加剂后进行功能鉴定可以发现，添加了本发明的细胞培养基添加剂所得到的人原代表皮角质细胞，与商业化培养基得到的角质细胞相比，其增殖能力和功能确实有显著的促进作用。
56.(3)采用本发明的细胞培养基添加剂所得到的人原代表皮角质细胞构建得到的三维重组皮肤模型，其种子细胞具备很强的增殖和扩增能力，皮肤模型组织结构更加优越，并且在表皮屏障功能和表皮基底层上具有显著的优越性，具有更加良好的应用潜力。
57.图1显示了采用实施例1的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；
58.图2显示了采用实施例2的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；
59.图3显示了采用实施例3的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；
60.图4显示了采用对比例1的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；
61.图5显示了采用对比例2的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；
62.图6显示了采用对比例3的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；
63.图7为人原代表皮角质细胞生长测试和形态观察，其中，图7的a为对照组培养基，接种5天后；图7的b为细胞培养基中加入实施例1的细胞培养基添加剂，接种5天后；
64.图8为人原代表皮角质细胞生长形态观察，其中，图8的a为epilife培养基中添加实施例1的细胞培养基添加剂；图8的b为keratinocyte basal medium 2培养基中添加实施例1的细胞培养基添加剂；
66.图10显示了三维重组皮肤模型的he组化染色和丝聚合蛋白以及ki67免疫荧光染色结果；其中，图10的a为250倍视野下对照组he组化染色结果；图10的b为250倍视野下优化组he组化染色结果；图10的c为100倍视野下对照组丝聚合蛋白免疫荧光染色结果；图10的d为100倍视野下优化组丝聚合蛋白免疫荧光染色结果；图10的e为100倍视野下对照组ki67免疫荧光染色结果；图10的f为100倍视野下优化组ki67免疫荧光染色结果。
67.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实
施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
采用表1中的不同实验例或对比例组合，分别添加到mcdb153基础培养基中，培养以相同密度接种的角质细胞，6天后观察细胞的生长情况。
具体结果参考图1至图6，其中，图1显示了采用实验例1的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；图2显示了采用实验例2的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；图3显示了采用实验例3的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；图4显示了采用对比例1的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；图5显示了采用对比例2的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况；图6显示了采用对比例3的细胞培养基添加剂添加至mcdb153基础培养基中，培养角质细胞6天后，观察细胞的生长情况。
人原代表皮角质细胞按照表1所示的添加了不同细胞培养基添加剂的细胞培养基中，置于质量分数为5％co2、37℃饱和湿度的细胞培养箱中培养。
由图1可以看出，添加了实验例1的细胞培养基添加剂的细胞培养基中，角质细胞生长6天后达到较高的密度，且细胞都能保持良好的形态。其它实验例2
3中的角质细胞生长6天后分化细胞的比例较低，因此呈现了较佳的细胞形态，细胞密度中等。对比例1
采用基础培养基为mcdb153，细胞培养基添加剂具体组成为实验例1培养角质细胞，同时采用添加了hkgs添加剂的epilife培养基(gibco品牌)作为对照组，结果参见图7，图7为人原代表皮角质细胞生长测试和形态观察，其中，图7的a为添加了hkgs添加剂的epilife培养基，接种5天后；图7的b为细胞培养基中加入实验例1的细胞培养基添加剂，接种5天后。
由图7可以看出，采用本案的细胞培养基添加剂培养的人原代皮肤角质细胞能更快达到对数增长期，其接种后扩增天数由原来的12天变为5天，细胞增殖速率得到很大提升。
此外，采用实验例1的细胞培养基添加剂，分别添加到其他商业化角质细胞基础培养基中，包括gibco品牌的epilife和promocell品牌的keratinocyte basal medium 2，培养角质细胞6天后观察细胞的生长情况。
实验例4为：基础培养基为epilife，细胞培养基添加剂具体组成为实验例1；实验例5为：基础培养基为keratinocyte basal medium 2，细胞培养基添加剂具体组成为实验例1。
实验例4以及实验例5的结果可以参见图8为人原代表皮角质细胞生长形态观察，其中，图8的a为epilife培养基中添加实验例1的细胞培养基添加剂；图8的b为keratinocyte basal medium 2培养基中添加实验例1的细胞培养基添加剂。
由图8可见，在添加了本发明添加剂组合的epilife和添加了本发明添加剂组合的keratinocyte basal medium 2中，角质细胞都能保持良好的生长状态。
并且，由此说明，本案的细胞培养基添加剂适用范围广，其可以在各个商业化原代角质细胞基础培养基中，提高表皮角质细胞的扩增效率，且细胞保持良好的形态。
在mcdb153基础培养基配方的基础上，添加实验例1的细胞培养基添加剂作为组合添加剂，培养得到的人原代表皮角质细胞进行功能鉴定。采用实时荧光定量pcr技术，测试表征角质细胞功能的关键基因的表达，对角质细胞扩增效率和相关基因flg、lor、krt1、krt10表达之间的相关性进行分析建模。通过细胞形态观察以及生长汇合后相关功能基因表达的情况，发现以这种培养基组合得到的人原代皮肤角质细胞，与商业化培养基得到的角质细胞相比，其增殖能力和功能确实有显著的促进作用。
为了进一步检测用本发明方法得到的人原代皮肤角质细胞的功能，利用实时荧光定量pcr检测人原代皮肤角质细胞的标志性基因：丝聚蛋白基因(filaggrin，flg)，角蛋白1基因(keratin
10，k10)，以及兜甲蛋白(loricrin,lor)基因的表达，基因扩增所用的引物序列如下表2所示：
步骤s1：复苏人真皮成纤维细胞，在体外进行扩增，待获得足够量的种子细胞后，消化收获细胞，将9
105个人皮肤成纤维细胞与大分子胶原溶液(该大分子胶原溶液为1.8ml的6mg/ml的市售大分子i型胶原溶液，购自sigma公司)混合培养3
dmem、10mm hepes、10mm nahco3、1％青霉素和链霉素以及10％fbs，培养条件为37℃，5％co2的湿化环境；
106个角质细胞接种至真皮层上，构建表皮层，其中，表皮层中的角质细胞通过细胞培养基在37℃、5％co2的湿化环境中培养获得，所述细胞培养基包括上述的细胞培养基添加剂；
上述方法中，细胞培养以及人体皮肤模型构建方法可以采用现有技术中的方法进行，例如shun kimura,ayako tsuchiya et al.,“tissue
scale tensional homeostasis in skin regulates structure and physiological function”，
当人体皮肤模型培养成熟后固定、脱水、包埋并制备成石蜡切片，进行he组化染色考察组织结构，同时进行免疫荧光染色考察皮肤模型的标志性蛋白，即丝聚合蛋白和ki67的表达分布情况，相关结果如图10所示。图10显示了三维重组皮肤模型的he组化染色和丝聚合蛋白以及ki67免疫荧光染色结果，其中，图10的a为250倍视野下对照组he组化染色结果；图10的b为250倍视野下优化组he组化染色结果；图10的c为100倍视野下对照组丝聚合蛋白免疫荧光染色结果；图10的d为100倍视野下优化组丝聚合蛋白免疫荧光染色结果；图10的e为100倍视野下对照组ki67免疫荧光染色结果；图10的f为100倍视野下优化组ki67免疫荧光染色结果。
如图10所示，结果显示采用本案所述的技术方案得到的人原代表皮角质细胞非常适用于三维皮肤模型的体外重建，与对照组细胞相比，本方法得到的细胞生长更旺盛，反映在更多的表皮层数和更厚的表皮厚度，且细胞间排列紧密，显示出更加完善的表皮屏障。免疫荧光染色结果显示用优化方法培养的角质细胞构建的皮肤模型能够表达更多的丝聚合蛋白和ki67,提示该皮肤模型具有良好的皮肤屏障功能，基底层细胞的代谢更新更加活跃。
也就是说，采用本发明的细胞培养基添加剂所得到的人原代表皮角质细胞构建得到的三维重组皮肤模型，其种子细胞具备很强的增殖和扩增能力，皮肤模型组织结构更加优越，并且在表皮屏星空体育官方入口 星空体育官网障功能和表皮基底层上具有显著的优越性，非常适合将其应用于非诊断目的的皮肤病研究、皮肤创面修复、皮肤药物开发以及皮肤美容产品安全性和功效性评估的评估。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包
含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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