近年来生物药市场需求量激增，高产量、高质量、低成本的哺乳动物细胞生产方式具有迫切的需求和广泛的市场。这样的过程不仅增加时间成本、人力成本，而且污染的风险大。近年来发展起来的哺乳动物细胞灌流培养工艺顺势成为工业界和学术界普遍关注的热点。灌流不仅可以维持细胞的高密度长时间生长，且细胞表达产物的异质性更低，尤其是表达双抗产品时，可减少表达产物聚集度，大大提高抗体产量。
采用灌流培养，与分批或流加培养相比，细胞可以长时间保持在指数生长期，并且能够达到更高的活细胞密度。在种子扩增培养过程中使用灌流，可以实现1:50、1:100甚至更高的接种比例，从而省略了传统种子扩增过程中多步扩增的过程，因而也进一步减少了污染的风险。
传统方法进行的细胞扩增，通常需要多个连续分批培养步骤。从冻存的细胞株开始，最初通常在摇瓶中进行扩增培养，最终需要扩增到生物反应器中进行培养。每轮扩增培养通常需要三到四天，并且不断更换到更大体积的反应器如50L、200L、500L，再到2000L。这通常需要大于2周的时间。为了节约时间，目前更多企业采用N-1灌流的方式，例如WAVE 25、传统生物反应器+ATF、批式混合培养技术(PB Hybrid Technology)等，均是为了获得高密度的细胞，获得足量接种大型千升反应器细胞数量。高密度灌流培养的成功一个先决条件是稳定的生物反应器系统，该系统具有精确的控制能力，能够在高细胞密度的情况下维持培养参数的稳定性。目前大部分生物制药企业都引进了ReadyToProcessWAVE 25细胞扩增系统，该系统可扩展性好，采用一次性细胞袋，全封闭式培养，杜绝污染。可全程自动化控制，实时监测和控制细胞培养中的参数，极为方便。
这里给大家介绍一种使用灌流法来制备高密度种子细胞库，并在WAVE 25进行种子扩增，实现一步种子扩增培养至2000L生物反应器的方法。与传星空体育 星空体育平台统工艺相比，大大简化了操作设备，减少了支出成本，节省了从冻存管到 N-1 生物反应器的种子扩增时间（图1）。
小贴士：灌流方法是指细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长过程中，不断地将部星空体育 星空体育平台分培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。
采用ReadyToProcess WAVE 25系统培养CHO细胞，制备高密度种子库。当WAVE 25中的细胞达到一定密度之后，加入低温保护剂DMSO，并浓缩体积，以4.5 mL体积/每管冻存细胞。接着从冻存的高密度细胞库中取一支到摇瓶中验证细胞的状态，如果细胞活率密度符合标准，可以在WAVE 25中扩大培养至10L，最后接种到2000L反应器中(图2)。
分析两种细胞的生长与代谢参数，CHODG44细胞，平均生长率为0.838 /day(倍增时间为19.9 h)，培养6天后收获，收获时活细胞密度为55.8×10 6 mL，活率 95%。CHO-S细胞，平均生长率为0.797/day (倍增时间为20.9 h)，培养6天后收获，收获时活细胞密度为48.8×10 6 mL，活率 95%（图3左）。
对于CHODG44细胞，葡萄糖浓度从开始培养时的6 g/L逐渐下降到第6天收获时的约1 g/L。乳酸在第3天增加到大约1.5 g/L，然后直到培养结束都保持相对稳定。CHO-S细胞，在培养的后几天葡萄糖和乳酸的浓度分别恒定保持在约2.5 g/L和1.5 g/L左右。结果表明，采用一定高的灌流速率可以将营养物和代谢物的浓度维持在一定水平，使细胞在整个培养过程中保持指数生长(图3B)。
2 L细胞培养液足以建立400支4.5 mL/支的高密度细胞库，每支细胞密度为50×10⁶细胞/mL。在细胞分装前的所有步骤均可在生物反应器中进行，无需单独的离心。
具体的方法是当ReadyToProcessWAVE 25系统中培养的细胞到达收获标准时，按1:1的比例向细胞袋中添加15% DMSO的预冷冻存液，细胞培养的初始体积为2L。搅拌速率从20转/分降低到15转/分。过滤截留细胞，泵出一半培养基，培养体系降至原细胞浓度和体积(2 L)。将细胞悬液抽出分装到4.5 mL冻存管中，标准方法冷冻。在液氮中保存一周后，取出一支在摇瓶中进行复苏以确定活细胞密度。在摇瓶复苏后的细胞活率90％（图4），与传统方法构建的细胞库一致。
细胞平均生长速率为0.853/day(倍增时间为19.5 h)，培养期间灌流的培养基总量为90 L（图6）。当细胞密度达到51.2×10⁶个活细胞/mL、细胞活率 95％时，收获CHO DG44细胞。
ReadyToProcess WAVE 25生物反应器系统能实时监控培养参数（图7）。即使在高细胞密度和大工作体积下，培养物中的溶氧也能够得到很好的控制。
为了在竞争激励的药物研发赛道中获得竞争优势，快速的药物生产方式成为企业的追捧。采用N-1灌流方式获得高密度的细胞，使得一步接种到大型生物反应器中成为可能，极大得缩短了时间。
目前市场上多种方式如WAVE 25、传统生物反应器+ATF、批式混合培养技术(PB Hybrid Technology)均可以获得高密度的细胞。WAVE 25装置简单，成本低；传统生物反应器+ATF通过在N-1生物反应器上配置细胞截留装置，提高补料分批工艺效率，节省时间和成本，但成本较高；PB Hybrid Technology一种将Perfusion和Batch培养方式结合起来进行细胞种子扩增的创新培养技术，同样可获得高密度的细胞库。
本文介绍的方法中展示了灌流培养策略在高密度细胞建库和种子扩增等种子培养应用中的优势。整个培养过程在有细胞截留膜的灌流生物反应器中进行，无需单独的离心步骤来浓缩细胞就可以建立高密度细胞库。并且建立的细胞库在复苏后显示出较高的细胞活性。仅用一支冻存细胞，足以直接接种到 1 L 的生物反应器培养液中，从而省略了摇瓶扩大培养的步骤。
利用反应器的灌流培养模式，可以在10天内完成从 4.5 mL冻存管到 10 L 培养液的高效一步式种子培养，活细胞密度为50×10⁶/mL，足以接种到初始体积为 1700 L、初始细胞密度为 0.3×10⁶ /mL 的 2000 升生物反应器中。
这种灌流培养方法不仅可以进行CHO细胞高密度培养，同时还能够简化制备细胞库工艺并提高种子扩增培养的效率。