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实验项目二住骨髓间充质干细胞的倍增时间与生长曲线的测定
发布:2026-04-29 07:05:28 浏览:

  取生长状况良好的P1、P3、P5、P9代细胞,用0.25%胰酶消化液,在37℃消化1-3min,制成单细胞悬液,然后以5x104个/ml密度接种到30个直径为35mm培养皿中,随机分成10组,每组3皿,每天检测一组中每皿的细胞总数,取3个皿的均值,如此至第10组结束,细胞技术如下(2004,司徒镇强)即一天消化3个组,共消化10天。P1,P3,P5,P9均如此,每代30个皿,共计120个皿。

  细胞群体倍增时间(PDT)=(t-t0)lg2/(lgNt-lgN0)t0培养起始时间,t,培养终止时间;N0培养初始细胞数,Nt培养终止细胞数。

  分别取两组0,1,3代细胞,制成1x103的细胞悬液,接种到96孔板,每孔细胞悬液200微升,置37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内孵育,各组每24小时分别取出4孔,每孔加入MTT(2mg/ml)20微升37℃孵育,4h后吸弃孔内培养液,每孔加入150微升分析纯的二甲基亚砜,移至酶联免疫检测仪上振荡10min,用分光光度计在492nm波长处测定每孔的吸光度值(OD492),以OD(492)值为纵坐标,时间为横坐标绘制生长曲线。

  取不同代数细胞,调整细胞浓度为2x104/ml后,接种于96孔培养板,置37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱培养后,用胰酶-EDTA进行消化,用台盼蓝拒染法计数活细胞,每天取12复孔,共7天;根据计数结果绘制细胞生长曲线。记录测得的结果,即培养潜伏期持续多长时间(12-24h),多长时间进入对数生长期(3天后),对数增殖期持续时间(3-5天),铺满皿底所需时间(5-7天),细胞进入平台期多长时间及持续多长时间,停止生长时间。

  将传至第4代生长旺盛pFMSCs(porcinefetalmesenchymalstemcells)细胞用0.25%胰酶+0.04%EDTA(称取胰蛋白酶0.5g和EDTA0.08g,溶入200mlPBS中,常温磁力搅拌器搅拌直至彻底溶解,用0.22μm孔径的滤膜过滤,无菌条件分装成星空体育 星空体育平台小瓶(4ml/瓶),-20℃冻存)消化3-5min,培养液中和,吹打成单个细胞,调整细胞浓度为2x104个/ml,接种在两个12孔细胞培养板中,每孔接种1ml,再补加培养液1ml,混匀。38.5℃,5%CO2,饱和湿度的条件下培养。常规换液。每24h用0.25%胰酶+0.04%EDTA消化液消化3孔细胞,细胞计数板计算每孔细胞总数,每孔记2次,取平均值。细胞接种当天记为第0天,连续测定8天。以时间(d)为横坐标,每天测定3孔细胞数的平均值为纵坐标,绘制生长曲线。

  胎猪骨髓间充质干细胞周期化处理:血清饥饿处理(当细胞生长到80%汇合时,将血清浓度由10%降成0.5%,继续培养2-4天;或者是利用接触抑制处理(当细胞生长至80%汇合时,继续使用含10%NBS的DMEM培养液培养2-3天。将上述处理的细胞常规消化离心,PBS重悬细胞,按每管106细胞分装于10ml离心管,离心,0.5mlPBS重悬细胞,边振荡边缓慢加入3ml预冷的75%乙醇,4℃过夜固定12h以上,离心去除乙醇,用含1%NBS的PBS重悬细胞,离心洗涤2遍,200μlPBS重悬细胞,加入0.8mg/mlRNase1ml,37℃,30min.离心,200微升PBS重悬细胞。加入含有100μg/mlPI0.1%X-100的PBS1ml,室温下作用10-15min,100目滤沙过滤,上机检测。进行流式细胞仪检测。

  分裂指数测定:用0.25%胰蛋白酶消化第3代细胞,以1x104个/cm2密度接种铺有盖玻片的6孔培养板中37℃、5%CO2培养箱中培养,每隔24h取出观察一次,PBS清洗三遍后,95%乙醇固定10min,PBS清洗三遍,置于5μg/mlDAPI内染色10min,PBS清洗后,滴加甘油油滴,封片后在荧光显微镜下观察,同倍镜下取5个不同视野,计数分裂相细胞,取平均值。连续7天,以时间(天)为横坐标,细胞分裂相的千分率(%)为纵坐标,绘制分裂指数曲线图。

  PMSCs分裂指数测定:用0.25%胰蛋白酶消化第3代细胞,以1x104密度接种铺有盖玻片的6孔培养板中37℃,5%CO2培养箱中培养,每隔24h取出观察一次,PBS三遍后,95%乙醇固定10min,PBS清洗三遍,置于5μg/mlDAPI内染色10min,PBS清洗后,盖在滴有甘油的载玻片上,封片后在荧光显微镜下观察,同倍镜下取5个不同视野,计数分裂相细胞,取平均值。连续7天,以时间(天)为横坐标,细胞分裂相的千分率(‰)为纵坐标,绘制分裂指数曲线】,来自:猪骨髓间充质干细胞培养参考

  大鼠MSCs生长曲线测定:为了定量测定大鼠BMSCs的生长状况,对来源于同一动物的原代细胞进行连续培养。分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液,调整细胞密度为5x104/ml。接种到96孔板,每孔接种200μl细胞悬液进行培养(每孔1x104细胞)。次日起每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃继续孵育4h后终止培养,吸出孔内上清,每孔加入150μlDMSO,室温振荡10min,使结晶充分溶解,于试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。在酶标仪上选择570nm波长,以空白孔调零,测定各孔吸光度(A)值,连续测7天,以时间为横轴,A值为纵轴绘制细胞生长曲线。

  取对数生长期细胞,消化计数,用MSC培养基制成细胞悬液(2x104/ml),0.5ml/孔在24孔板中培养。每天取3复孔,台盼蓝染色计数活细胞数,计算平均值,连续观察6天。以培养时间为横轴,细胞数为纵轴,绘制细胞生长曲线。Patterson公式计算细胞在对数生长期倍增时间,即Td=Tlg2/Lg(Nt/N0),Td:倍增时间(h);T:细胞由N0增至Nt所用的时间(h),N:细胞数。