华东理工大学硕士学位论文,页录一章文献综述……………………………………………,,,重组单抗药物发展与应用………………………………, , ,, ,用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术……………………,, ,除病毒实验简介………………………………………, ,, ,本文的研究内容与实际意义……………………………, , ,,二章细胞种子复苏扩增优化…………………………………,,, ,前言………………………………………………, ,,, ,实验材料……………………………………………,,, ,研究内容,细胞扩增优化实验方案及其适用性及稳定性………, , ,,, ,, ,细胞扩增实验方案…………………………………, ,,, ,, ,生产规模发酵实验方案………………………………,,, ,细胞扩增优化实验方案及其适用性及稳定性实验结果与讨论……, ,,, ,, ,种子扩增实验结果…………………………………,,, ,, ,种子扩增优化工艺的生产发酵实验结果与讨论……………,,, ,细胞扩增工艺改进实验方案小结…………………………, ,,三章纯化离子交换层析主峰超滤前增加除病毒过滤工艺优化………, ,,, ,前言………………………………………………, ,,, ,实验材料……………………………………………,,, ,研究内容,纯化离子交换层析主峰超滤前增加除病毒过滤工序实验方案 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, ,, ,选择实验的对象…………………………………, , ,,, ,, ,除病毒过滤器清洁试验……………………………, , ,,, ,, ,病毒挑战性试验…………………………………, , ,,, ,, ,产品适应性与操作参数实验…………………………, ,,, ,, ,生产规模纯化实验…………………………………,,, ,纯化离子交换层析主峰超滤前增加除病毒过滤工序实验结果与讨论, , ,,, ,, ,除病毒过滤器清洁实验结果与讨论……………………, ,,, ,, ,病毒挑战性试验结果与讨论…………………………, ,,, ,, ,病毒去除效果……………………………………, ,,, ,, ,生产规模实验结果…………………………………, ,,, ,纯化离子交换层析主峰超滤前增加除病毒过滤工序实验小结……, ,,, ,, ,除病毒过滤器清洁实验小结…………………………, , ,,, ,, ,病毒挑战性试验小结………………………………, ,,, ,, ,生产规模试验小结…………………………………,,四章结论与展望…………………………………………,,, ,结论………………………………………………, ,,, ,, ,种子复苏、扩增工艺优化结论………………………, , ,,, ,, ,除病毒过滤工序优化结论……………………………,,
第,页东理工大学硕士学位论文, ,展望………………………………………………,,考文献, ………………………………………………, , ,,
华东理工大学硕士学位论文,页, ,重组单抗药物发展与应用体药物的兴起源于,,世纪末,伴随着当时分子生物学技术的蓬勃发展,及人们通过对抗体分子构成及其作用机制的深入研究总结,最终开发出了重组抗类药物, 当前伴随着生物技术中各种基因技术的进步,在对抗体完成人源化造的进程上,又不断有新的方法设想涌现,但是无论如何,所有这些操作必须循以下两个通用准则,其一应尽量消减甚至基本去掉抗体自身的免疫原性,其应当尽可能保持其抗体特异性与亲和力,特别是应避免失去该抗体特异性结合标抗原的能力,所以,如何有效降低抗体药物自身的免疫原性、 同时提升亲和以及保持其自身的免疫学活化作用是抗体药品开发的关键。组抗体药物的应用,近年来借助于生物学在微观领域的进步与更深入的理,带动了单抗类生物制品的应用发展的加快,治疗性单抗药物已有百余个处于期临床,其中有,, ,用于肿瘤治疗,近,, ,用于过敏症、机体免疫紊乱引起的症和感染性症状等, 国内批准的,个单抗,其中, 鼠源、嵌合抗体,个,其余人源化的单抗。近,年来,重组抗体药物的发展经历了高峰、谷底、再高峰个阶段,展示了良好的发展势头。单抗药物技术在当代生命科学发展上己成为端成果。这方面的基本科学技术基石,例如分子生物学,病理学,药化,药动学等基础学科, 以及细胞, ,,,技术,大规模培养技术相结合的,综合国内外,,工程抗体药物研发的最新进展,我国抗体领域应加强抗体药物的先期创新,高抗体中下游核心技术,减小差距,使之更广阔地应用于肿瘤、病毒感染、阿茨海默病、 自身免疫性疾病的医治中去。, ,用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术前,多种表达系统均可实现重组抗体的异源表达,但是抗体药物的产业化备,始终以动物细胞大规模培养工艺为主。 ,,,,年首个治疗性抗体,,,,,,市之初,动物细胞表达水平普遍不足,,,,,,,。经过近三十年间发展,业内用重组抗体生星空体育登录入口 星空体育在线官网产的动物细胞培养工艺,无论细胞培养密度,还是抗体表达水平均高五十倍以上。流加培养工艺中细胞密度可达,,,,,,,, ,,,,, 日均产量,,,,,,, ,,,以上,最高可达,,,,,,,,,,,最终收液的容积产率可达,,,,,,,最第,页东理工大学硕士学位论文达,,,,,,培养体积可达,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,, , ,,,,,灌注培工艺中细胞密度可达,×,,,,,, ,,,,,抗体容积产率最高达,,,,,,,,,,,,,,,,,司,,灌注系统,。 以上行业技术水平的飞速提升,既源于上游细胞系构建技的突破,也得益于细胞大规模培养工艺的日臻成熟。尤其是后者综合培养基开,工艺优化,结合新型生物反应器的使用,实现了动物细胞的高密度、高表达养,满足了临床上对于抗体药物”公斤级”产能的需求。物细胞培养的过程参数与培养模式物细胞的体外培养,涉及生物反应器的物理参数,温度、 ,,、 ,,、 ,,,,,、培养基的营养成分,葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、维生素等,的消耗, 以自身代谢产物,乳酸、氨、重组蛋白等,的积累与生理生化参数,细胞密度、性,能荷等,的变化。作为重组抗体生产的”细胞工厂” ,上述过程参数的改变直接影响生产细胞系的活性与重组抗体的收率。 比如, 当乳酸、渗透压、氨参超过其相应的阈值,细胞活性和抗体产量均会明显下降。加培养方式及优化策略前上市的重组抗体中绝大多数,如, ,,,,,,,,、 ,,,,,,,,,,,、 ,,,,,,,,,、,,,,,,,,,是采用流加,,,,,,,,,培养工艺生产,这主要由于与之配套的生反应器,搅拌罐、气升罐等,制造成熟,可线形放大,最大至,,, ,,,,,,操简单等原因。但是,流加培养过程中会出现营养物质消耗、代谢废物积累, 以产品质量不稳定等问题。因此,流加培养工艺的优化主要集中在基础培养基、加培养基以及流加策略上,其优化的原则是根据细胞的代谢特点设计补料培养,用于补充易耗成分,降低副产物积累。注培养方式及优化策略注培养模式,,,,,,,,,,,下,反应器几乎可实现”恒化器”培养效果,细胞度、蛋白产量可较流加模式提高数倍。但是灌注培养细胞截留需特殊装置,工放大存在难度,其产业化应用的经济性尚存争议。 目前,只有少数抗体,如,,,,,,,,、 ,,,,,,,,,,、 ,,,,,,,,,,、 ,,,,,,,,,、 ,,,,,,,,,等,及易降解重组蛋白 ,凝血因子,等使用该工艺。灌注培养工艺优化,主要集中在灌注培基及灌流速度上。优化原则是通过降低灌流速度,提高培养基的利用率和物的容积产率。外,控制流加灌注工艺,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,同时具有流加工艺和灌华东理工大学硕士学位论文,页工艺的优点。该工艺对易产生代谢废物的营养进行限制性流加。根据细胞摄氧的变化,流加氨基酸以满足高密度细胞的营养需求。于提高重组抗体表达水平的方法物细胞的高密度培养,有赖于合适的培养基以及适宜的反应器环境。因此,在提高重组抗体表达的工艺开发,主要集中在”个性化培养基”的开发以及过程数的优化上。上述研究通常需要借助小型化反应器,如传统的三角瓶、孔板,管,,,,,,,,,,等。近年,新型自动化小规模反应器,,,,,,,,,,,,、 ,,,,,, ,,,、,,,,, ,,,,, ,,,,,,等,不断出现,此类装备不仅能模拟反应器的,,、 ,,、养基流加等控制条件,而且能够实现试验条件的通量筛选,大大加速了细胞培工艺开发的进程。如,,,,,, ,,,可同时使用,,,个微型反应器,,,,,,,进工艺条件筛选。,,,,,, ,,,,可在孔板规模,,,,,对,,反应器,,, ,,,温等不同条件进行模拟。养基优化方法期的动物细胞培养基中常含有胎牛血清或小牛血清。近年工业用培养基的发趋势, 已经转向无蛋白 ,,,,、无动物源,,,,,,,甚至化学成分明晰培基,,,,。此外,抗体生产企业在培养基开发过程中,还应充分考虑培养基成、生物安全性与质量稳定性,避免动物源血清、植物源蛋白水解物,以及下游化工艺的兼容性等问题。乳动物细胞对营养的需求差别很大,如,,,细胞的生长依赖于外源性固醇,杂交瘤细胞、 ,,,细胞多为谷氨酰胺营养缺陷型。此外, 即使基于同宿主细胞所构建的的不同克隆,其代谢特点与营养需求也不尽相同。因此,在养基的开发过程中需特别强调”个性化培养基”的概念, 即,生产细胞系所使用培养基应根据其代谢特点进行优化、定制。下述方法在用于培养优化均有提高组抗体表达的报道。分滴定法,,,,,,,,,,,,,,,,,,是通过设计培养基组分的浓度梯度,来确其最优浓度。 由于动物细胞用培养基成分复杂,常含有,,种组分以上,,且存”协同效应” 。所以,该方法只适用优化培养中的个别组分,如胰岛素、水解物、长因子等,。养基混合法,,,,,,,,,,,,,,是通过对成分己知的原型培养基进行不同例混合。借助,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,软件进行试验设计与分析,快第,页东理工大学硕士学位论文确定最优培养基配方。耗组分分析法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,通过对批式培养过程中各组分的消情况进行分析,及时补充易消耗组分,调整流加策略。该方法由于检测手段所,主要用于葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等组分的优化。学计量分析法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,利用简化的数学模型,建立葡萄、氨基酸,维生素与细胞生物量与重组蛋白合成, 以及能量代谢之间化学计量系。据此进行初始培养基、流加培养基以及流加策略优化,可减少乳酸、氨的产,该方法在上世纪九十年代提高重组抗体产量至,, ,,,,。性培养基设计,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,综合上述三种培养基优化法。先对大量培养基候选物及混合配方进行筛选,利用最初确定的基础培养基行批式培养,分析培养基中易消耗组分,据此设计流加培养基和流加策略。最,利用组分滴定法确定流加培养基其他添加物,水解物,的最适浓度。最后,化过的基础培养基、流加培养基及补料策略,在迷你反应器上进行验证。这也大多数,,,公司,,,,,,、 ,,等,开发定制培养基的主要方法。统培养基开发,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,是将培养基成分分为氨基酸、维素、核苷酸等若干组,首先判定对细胞表达影响较为显着的组别,再针对该组进行重点的成分优化。相培养与代谢转化,绝大多数重组蛋白的生产采用”两相培养工艺”,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,该工艺中”生长期”与”生产期”采用完全不同的控制策,如降温、调节,,,改变流加策略等。此工艺中细胞的代谢状态发生明显的化,称之为”代谢转化现象” ,,,,,,,, ,,,,,,,即,生长期细胞代谢旺盛,产生量乳酸,而进入生产期后,细胞生长受到抑制,乳酸产量随之变小,直至消耗。进异源蛋白表达的小分子物质,某些小分子化合物可以通过改变细胞周期,进重组蛋白的表达。直接在培养基中添加这种物质,是提高目的蛋白产率的简方法。此类物质中丁酸钠,,,,,,和二甲基亚砜,,,,,,应用最多。胞培养工艺对重组抗体质量的影响为生物大分子的重组抗体, 同时具备聚体、降解、糖基化修饰、氧化、脱基化、异构体、二硫键错配等多种变异形式。 由”细胞工厂”异源表达的重组抗,其绝大部分质量变异与生产细胞对重组蛋白的翻译后修饰作用直接相关,随,,,、 ,,,,对于抗体药物关键质量属性,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,的定义第,页东理工大学硕士学位论文荷变异与氨基酸变异,多种化学修饰都会引起重组抗体等电点的改变,如,酰胺化、唾液酸化、重链,端赖氨酸清除会造成重组抗体的带正电荷,赖氨,甘氨酸酰胺化反应、 甲硫氨酸氧化作用等会造成重组抗体带负电荷。提高培基中,,,,浓度,降低,,,,浓度,可以增强重组抗体,端脯氨酸的酰胺化,最导致重组抗体发生碱性电荷变异。外,重组抗体的异源合成中易发生某些氨基酸变异,如,,,被,,,随机替。可以通过降低培养基中,,,含量,或提高含量,,,来减少此种变异发生频率。业化阶段中细胞培养工艺的建立体药物的不同研发阶段,对工艺开发的要求不尽相同。处于临床前研究阶,生产工艺仅需满足制备样品。进入临床研究后,随着抗体蛋白的需求增加,养工艺面临着工艺放大与技术转移。而抗体药物进入到临床三期研究阶段后,备上市生产销售的可能,生产企业则需确定生产工艺,并对该工艺进行充分的性研究,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,、认证工作,,,,,,,,,, ,,,,,,,,。此阶段的艺开发,更多强调的是工艺的”鲁棒性”以保证重组抗体质量的”一致性” 。胞培养的工艺放大与技术转移胞培养工艺的放大与转移过程中,首先应保证工艺变更前后细胞活性、产收率、产物质量等主要技术指标的维持不变。培养工艺的放大原则多采取,非积依赖参数保持不变,温度、 ,,、 ,,等,,体积依赖参数,工作体积、流加积、通气量,线性放大。反应器的放大至生产规模,,,, ,,,,,,反应器的选型充分考虑,混匀时间,,,,,,,,,,,、溶氧供应和二氧化碳的去除等因素是否足培养工艺的要求。与之相关的搅拌转速设定和搅拌桨几何尺寸的设计最为复。前者多根据比体积输入功率、搅拌桨线速度、搅拌桨剪切速率、总循环时间、匀时间等计算得出。胞培养的定性研究与工艺验证年, ,,,推行”质量源于设计” ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,的理念,其核心充分认识原材料及生产工艺对产品的关键质量属性,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,造成的影响。 以及,,,,与临床疗效之间的关系。根据这一要求,产业阶段需要对细胞培养工艺进行充分的定性研究。此项工作多使用”规模缩小”,,,,,,,,,模型,采用”失效模式与影响分析” ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,的方法,对诸多工艺参数,接种量、培养温度、 ,,、 ,,等,进行风华东理工大学硕士学位论文,页排序,确定关键工艺参数及操作范围。此外,细胞培养工艺满足药物上市评审求还需有生产规模的实验数据进行支撑, 即所谓的”工艺验证” 。 ,,,和,,,,别要求连续,或,批连续的生产规模试验数据,并以此为”生物制品许可申请”,,,,文件的的重要内容。着组学技术的发展与应用, 目前的细胞培养工艺开发, 已经从简单的工艺数优化,进入系统的组学研究深度,生产细胞的代谢网络与重组抗体合成机制益清晰。对于生产细胞系在不同工艺条件下抗体产量的差异, 已经能够从基因、蛋白组、代谢组等不同层次进行分析、解释。这就为今后大规模细胞培养工开发提供了新的线索。 同时,业内随着” ,,,”理念的深入,越来越多的”过程析技术” ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,开始应用于细胞培养过程, 旨在通过强关键过程参数的监控来确保蛋白药物的最终质量。如,培养基检测、培养过监控、多批次数据分析等。未来基于重组抗体表达的细胞大规模培养工艺开发,朝着稳定产能,提高质量的方向发展。, ,除病毒实验简介物制药公司需要证明其下游流程,去除在生产过程中可能出现的内源性或源性的病毒。工艺设计者通常设计缩小规模的模型实验,将选定的病毒加入到品中间体中,对病毒清除工序,如过滤、亲和、热灭活或化学失活等,进行的验实验,从这个试验可以看出除病毒工序的实际作用,一般而言公认以,个对减少值可认定为行之有效的病毒去除,为避免按实际生产水平进行实验产生的大成本,一般选择设计较小规模的除病毒实验。所有这一切的前提是,设计的种试验是认定可以完全模拟我们实际的大规模生产为前提的,然而,在实际实过程中,过滤中间体的种类和组份、蛋白浓度、纯度及其聚集程度、其,,,,,,液成分等都会直接或间接影响到过滤膜的能力,并且实验选用的病毒液本身对膜性能也会产生影响,而且由于病毒液本身就可能含有杂质蛋白、细胞碎片等扰成分,这会使工序速率降低,而中间体流量的降低还会导致体积较小的病毒生穿透滤膜的现象,而所有这些情况都可能影响过滤膜的载量、通过率、工序程时间及潜在的病毒截留。 由于病毒液的不确定性,可能在加入后明显改变了膜的性能,从而使病毒去除实验无法模拟真实的生产情况,导致实验的最终失,所以使用纯净的病毒液,减少除病毒试验的负面影响,进而使设计的试验能第,,页东理工大学硕士学位论文更接近真实的反应实际生产的情况,实际上在某些情况下,设计这种缩小规模实验,在放大后有可能不能反映实际所遇到的情况, 比如在实际生产中, 中间中的杂质可能导致滤膜比预想的时间来得早的堵塞现象,而在试验中因为规模缩小,一般这个问题不会得到暴露,而我们在设计实际所需的滤膜一般是按体处理量来计算所需要的滤膜处理能力, 因此实际的滤膜面积要比理论计算中来大,这样不但会增加出病毒过滤工序的成本,还会因滤膜面积增大而随之带来意想不到的问题。们设计实验的目的是为了模拟真实的大规模生产过程,但实验原料中的杂会让我们完全无法达到预想的目的的。错误的使用含有杂质的病毒液会使实验得的滤膜面积大于实际所需的面积,最终提高此后生产的成本。更严重的是,质会使滤膜堵塞,使实验干扰因素增多,复杂化,从而影响到实验的准确性,终使整个病毒截留实验不能真实地反映实际大规模生产所面临的情况。, ,本文的研究内容与实际意义文的第一个实验是在种子复苏扩增阶段进行发酵工艺优化种子摇瓶扩增验。选定最优的种子复苏扩方案。增加种子复苏后的总细胞数与目标蛋白的产。并运用进行,批次完整的种子复苏,扩增,一级种子罐,二级种子罐,生产的生产实验,考察改进后工艺的适用性及稳定性。过对三种预先设计的扩增方案实验结果的对比分析,筛选出最优化的种子增复苏方案,可以在相同的时间内提供更多的高表达的细胞。为后续的生产罐大规模培养提供更优质的基础,为高效表达创造先决条件。文的第二个实验是设计病毒过滤工序作为除亲和层析和低,,孵育灭活外第三种除病毒机制。根据文献资料显示, ,,,,,,,,亲和层析对,种指示病毒,,,、 ,,,、 ,,,、 ,,,,均有较好的去除作用, ,,,在,,,以上。使用,,次的旧柱,其去除病毒的效果与新柱相比无显著差异,仍可有效去除病毒。和层析主要对病毒起分离作用,大部分病毒在上样及平衡过程中未与介质结合流穿。所以一般普遍认为亲和层析和低,,孵育灭活可有效去除病毒,为了提产品内在质量,进一步降低产品病毒安全风险,计划在离子交换层析主峰超滤增加除病毒过滤工序,为第三种清除病毒机制。 同时也可满足,,,药品注册国际技术要求,来源于人类亦或动物细胞系生物技术产品能够证明至少有两种华东理工大学硕士学位论文,页上不同机制对病毒进行清除。实验通过设计,批的缩小规模的实验模拟正式的生产情况,证明该工序具清除病毒的作用,并通过分析病毒去除效果与滤速的关系、病毒去除效果与过体积的关系,推导出出实际生产中关键参数并对除病毒滤器降低病毒负荷的效做出定量评估,得出保证病毒去除效果的最大单位体积载量,新增除病毒过滤验完成后,我们对整个纯化工艺进行正式生产规模的放大实验, 以证明纯化工能够达到除病毒、除杂质、降低星空体育登录入口 星空体育在线官网细菌内毒素得到纯度符合标准的目的蛋白原液,足安全、有效、均一的药品要求。第,,页东理工大学硕士学位论文, ,前言二章细胞种子复苏扩增优化子复苏、扩增是蛋白原液生产工艺的第一步,是决定最终产品质与量的关工序。为进一步稳定种子复苏、扩增的过程,对原有工艺进行优化实验,在种复苏扩增阶段进行发酵工艺优化种子摇瓶扩增实验。选定最优的种子复苏扩方。在选定新工艺方案后,进行,批次完整的种子复苏,扩增,一级种子罐,二种子罐,生产罐的生产实验,考察工艺的适用性及稳定性。, ,实验材料组细胞, ,,,,,,培养基的主要成分为提供的国家抗体中心的,,,系列血清无动物源性培养基干粉,药用级的碳酸氢钠和药用级葡萄糖, 以及调节,值的,,,,和,,,。, ,研究内容,细胞扩增优化实验方案及其适用性及稳定性, ,, ,细胞扩增实验方案验主要内容包括,三种不同扩增方案的扩增过程。艺操作步骤 , , ,苏苏,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,一管,加入,,,,,培养液,摇瓶置于振荡培养箱,荡培养。, ,, ,, ,扩增照下表采取,种不同的方式扩增,振荡培养箱设置,,。 ,, ,,,,,,, ,,,,,。华东理工大学硕士学位论文,,页,, ,, ,, ,三种扩增方式,,,,, , , ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,生产规模发酵实验方案子复苏、扩增是目标蛋白原液生产工艺的第一步,是决定最终产品质与量关键工序,为进一步稳定种子复苏、扩增的过程,对原有工艺进行优化, 由孵箱培养变更为振荡摇床培养,使得培养过程中营养物质及气体,,,,、 ,,等,散的更均匀,更有利于细胞扩增,在选定优化后的种子扩增工艺后,完成完整批细胞培养生产,过程细分为工作细胞复苏、扩增,一级种子,二级种子,生罐,发酵液后处理,考察变更后的工艺条件下的工艺稳定性,证明该工艺的稳性与符合性。 , , ,瓶种子液制备作细胞库细胞复苏,从目的蛋白工作细胞库取出,支,迅速置,,,,,, ,℃水第,,页东理工大学硕士学位论文,至完全融化。瓶种子液扩增,接种于,,,,,摇瓶中, ,,,,, ,。 ,培养,复苏的细胞利用摇培养逐级进行扩增,培养至达到一级种子密度要求,,,,,,,, ,, ,,并且细胞率大于,,,,,接种于一级种子罐。, ,, ,, ,一级种子罐细胞培养养方式,补料批次或连续灌注培养,直至细胞密度和活率达到接种要求。胞培养要求,在细胞培养全过程中必须注意无菌操作,细胞培养完毕,必按照操作规程将所有活性细胞灭活处理后方可进行开放操作,如清洗反应器,。级种子罐指标, 当达到下列要求,活细胞率达到,,,以上,显微镜镜检无常, 电泳可见明显的目标蛋白条带, 同时细胞应处于对数生长期或对数生长期期, 内毒素小于,,,,,,, 即可达到接种,,级种子罐要求。 , , ,级、三级种子罐养方式,补料批次或连续灌注培养,直至细胞密度和活率达到接种要求。胞培养要求,在细胞培养全过程中必须注意无菌操作,细胞培养完毕,必须按操作规程将所有活性细胞灭活处理后方可进行开放操作,例如清洗,。二级、级种子罐指标,保持活细胞率,,,以上,显微镜镜检无异常, 电泳可见明显的标蛋白条带, 同时细胞应处于对数生长期或对数生长期后期, 内毒素小于,,,,,,, 即可达到接种生产罐要求。, ,, ,, ,生产罐细胞培养养方式,补料批次细胞培养,添加培养基和葡萄糖溶液。细胞培养要求,胞培养过程必须无菌操作, 同一区域内不得同时进行其它品种的细胞培养。细培养完毕,必须按照操作规程将所有活性细胞灭活处理后方可进行开放操作。胞培养液收获指标,在正常的培养周期中,蛋白表达量不再有增加趋势, 即可到放罐要求,, ,, ,, ,细胞培养后处理胞培养液的收获, 当细胞符合收罐条件后,细胞培养液降温到,,±,℃,止溶氧、 ,,控制,关闭底部通气,维持搅拌。细胞培养液通过碟式离心机离分离。离心后收集上清液,收获的细胞经灭活处理后排放。上清液的澄清和生负荷度下降。上清液通过单级多层深层过滤或多级单层深层过滤或联合使用去大部分离心未除尽的细胞碎片。华东理工大学硕士学位论文,,页, ,, ,, ,活性物质的处理、排放胞培养过程中取样或废弃连续灌注细胞培养液等,须经过生物灭活后才允向下水道排放。灭活方法,活细胞灭活可采用大量水稀释,使细胞渗透压剧烈化,细胞破碎灭活,或通过化学试剂,,,,,,新洁尔灭等,进行灭活。, ,细胞扩增优化实验方案及其适用性及稳定性实验结果与讨论, ,, ,种子扩增实验结果过对三种预先设计的扩增方案实验结果的对比分析,筛选出最优化的种子增复苏方案,可以在相同的时间内提供更多的高表达的细胞。为后续的生产罐大规模培养提供更优质的基础,为高效表达创造先决条件。要工艺操作步骤说明,苏,复苏,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,一管。加入,,,,,培养液,摇瓶置于荡培养箱, ,,。 ,, ,,,,,,, ,,,,,振荡培养。增,按照下表采取,种不同的方式扩增,二氧化碳振荡培养箱设置,,℃,,,,,,, ,,,,,。, ,, ,, ,目的蛋白种子复苏及扩增步骤一一方案一结果,, ,, ,, ,方案一的实验结果,,,, , , ,,,,,,,,,,,,,,,,第,,页东理工大学硕士学位论文,, ,, ,, ,, ,方案一中细胞总数与培养时间,天,的关系图,, , , , , ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,经过,,天的培养,细胞总数有了很明显的提升。 由,,,,,上升到,,,,,,,增加了,,,倍。,, ,, ,, ,, ,方案一中细胞活率与培养时间,天,的关系图,, , , , , ,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,经过,,天的培养,细胞活率稳定在一个比较高的水平上, ,,,左右,培养程相当平稳。,,一一…一一一华东理工大学硕士学位论文,,页过,,天的培养, 目标蛋白的表达量稳步提升, 同细胞增长的曲线相似。明目标蛋白的增加主要是由于细胞总数的大量增加造成的。案一扩增实验结果,从方案一的实验结果上看经过,,天培养,细胞总细数增加,,,倍,表达增加约,, ,,倍,细胞活率基本保持在,,,的水平线上。, ,, ,, ,目的蛋白种子复苏及扩增步骤一一方案二结果,…,,方案二的实验结果,,,, , , ,,,,,,,,,,,,,,,,三,主,古图,, ,…,,方案二中细胞总数与培养时间,天,的关系图,, , , , , ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,第,页东理工大学硕士学位论文过,,天的培养,细胞总数有了很明显的提升。 由,,,,,上升到,,,,×,,,增加了,,,倍。,, ,…,方案二中细胞活率与培养时间,天,的关系图,, , , , , ,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,过,,天的培养,细胞活率稳定在一个比较高的水平上, ,,,左右。培养程相当平稳。,,一,, ,,, ,,,,,一,●—■,【 ,,,, ,, …,●■,●, ,,忡,,删,图,, ,, ,, ,, ,方案二中目标蛋白表达量与培养时间,天,的关系图,, , , , , ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,过,,天的培养, 目标蛋白的表达量稳步提升, 同细胞增长的曲线相似。明目标蛋白的增加主要是由于细胞总数的大量增加造成的。案二扩增实验结果,从方案二的实验结果上看经过,,天培养,细胞总细数增加,,,倍,表达增加约,, ,倍,表达增加约,, ,,倍,细胞活率基本保持在,,的水平线上。, ,, ,, ,目的蛋白种子复苏及扩增步骤一一方案三结果华东理工大学硕士学位论文,,页营,主,,图,, ,…,,方案三中细胞总数与培养时间,天,的关系图,, , , , , ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,过,,天的培养,细胞总数有了很明显的提升。 由,,×,,,上升到,,,,,,,。增加了,,,倍。第,,页东理工大学硕士学位论文,蚋睫,,审,帕图,, ,…,,方案三中细胞活率与培养时间,天,的关系图,, , , , , ,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,过,,天的培养,细胞活率稳定在一个比较高的水平上, ,,,左右。培养程相当平稳。 , , , , , , , ,, , , , ,,, ,, , , , ,,, , , ,, , , , ,,, , ,, , ,, ,, ,,,’一。 ’一————一一—华东理工大学硕士学位论文,,页,, ,, ,, ,, ,三种方案的细胞密度对比图,, , , , , ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,, ,, ,三种方案的总细胞数对比图,,, , , , ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,, ,, ,三种方案的细胞活率对比图,, , , , , ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,