1、b细胞是免疫细胞，负责多种功能，包含帮助身体抵抗传染和疾病。所述细胞能够分泌响应于所识别抗原的抗体，呈递抗原，并且还分泌细胞因子。在癌症中，已经在某些肿瘤周围的三级淋巴结构(“tls”)中发现了b细胞。tls包括免疫细胞(包含t细胞和b细胞两者)的聚集体。所述聚集体在肿瘤中的存在与更好的患者预后相关。参见例如，helmink,b.a.等人,《自然(nature)》,2020,577(7791),549-555；petitprez f等人,《自然》,2020,577(7791),556-560。
2、lps激活的脾细胞(包含b细胞)与检查点抑制剂的组合的瘤内注射已经显示出产生抗肿瘤应答。soldevilla等人,《肿瘤免疫学(oncoimmunology)》,2018,7:8,e1450711。进一步，鉴于b细胞具有呈递抗原和分泌蛋白质的天然能力，作为用于靶向某些患病细胞类型并分泌治疗性有效载荷的细胞疗法具有很大的潜力。
3、然而，扩大用于细胞疗法的工程化b细胞的生产规模是一个具有挑战性的过程。几十年来，已经通过表达cd40配体(“cd40l”)的饲养细胞层系统实现了b细胞的体外激活和增殖。banchereau,j.等人(1991)《科学(science)》251:70–72；schultze,j.l.等人(1997)《临床研究杂志est.)》100:2757–2765；liebig,t.m.等人(2009)《视觉实验杂志(j.vis.exp.)》32:1373。这些系统都有一个共同的缺点，即它们依赖表达cd40l的饲养细胞层。饲养细胞的使用阻碍了激活和增殖过程的标准化，并且在方案中引入了变量。
4、使用cd40l已经描述了b细胞的扩增，具有混合的结果。参见例如，wennhold等人,2019,《移注医学和血液疗法(transfus med hemother)》,46:36–46。一些方法导致低扩增产量，产生的b细胞数量不足以用于细胞工程化和用于将b细胞用作治疗剂以施用于患者。因此，需要改进的b细胞扩增技术、生长培养基等。
1、本发明总体上提供了用于扩增细胞群体，具体地b细胞群体的改进的方法。本发明进一步涉及改进的细胞培养基、其组合物以及使用此类经扩增的b细胞的方法。这种新型方法包含使用新型cd40l融合蛋白、交联抗体和il-4和/或il-21。此类方法对工程化b细胞的有效激活和增殖至关重要，使得功能性扩增b细胞的期望水平增加200倍。
2、本文所提供的用于扩增b细胞的方法优于常规方法，因为迄今为止的常规扩增方法导致不期望的低细胞扩增，并且因此降低了工程化b细胞的产量。适当的细胞功能和产量在细胞疗法中是至关重要的，对于同种异体治疗，并且具体地在自体治疗环境中，其中通常仅一次机会来采集患者的细胞、培养、扩增、工程化和施用有效剂量的此类细胞。
3、在各个实施例中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：从来源获得b细胞群体；在包括cd40l融合蛋白和cd40l交联剂的培养基中培养所述b细胞；对所述b细胞进行工程化以表达有效载荷、嵌合受体或两者；以及向所述受试者施用所述b细胞。在各个实施例中，所述来源是哺乳动物。在各个实施例中，所述来源是包括外周单核血细胞的生物样品。
4、在各个实施例中，所述cd40l融合蛋白包括与seq id no:3至少85％相同的氨基酸序列。在各个实施例中，所述cd40l包括与seq id no:3至少95％相同的氨基酸序列。在各个实施例中，所述cd40l融合蛋白包括seq id no:3融合蛋白的氨基酸序列。在各个实施例中，所述cd40l交联剂是抗体。在各个实施例中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括与seq id no:5至少95％相同的氨基酸序列，所述重链可变区包括与seqid no:7至少95％相同的氨基酸序列。在各个实施例中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括seq id no:5的氨基酸序列，所述重链可变区包括seq id no:7的氨基酸序列。
5、在各星空体育 星空体育平台个实施例中，在含有cd40l融合蛋白和cd40l交联剂的培养基中培养所述b细胞之前，所述b细胞被工程化。在各个实施例中，在含有cd40l融合蛋白和cd40l交联剂的培养基中培养所述b细胞之后，所述b细胞被工程化。在各个实施例中，所述方法进一步涉及在存在il-4的情况下培养所述b细胞。在各个实施例中，所述方法进一步涉及在存在il-21的情况下培养所述b细胞。
6、在各个实施例中，所培养的b细胞表达以下标志物中的至少一种标志物：cd62l、ccr7、cd80、cd86、cd54、icam、cd58或cd27。在各个实施例中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：癌症、心脏疾病、炎性疾病、肌肉萎缩疾病或神经疾病中的至少一种。在各个实施例中，所述癌症是以下中的至少一种：乳腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌；肺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肝细胞癌、间质瘤如gist、胶质母细胞瘤和神经胶质瘤。在各个实施例中，至少约3×107个b细胞被施用于所述受试者。在各个实施例中，所述b细胞群体被培养至少14天。
7、在各个实施例中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：从来源获得b细胞群体；在包括cd40l融合蛋白和cd40l交联抗体的培养基中培养所述b细胞，其中所述cd40l融合蛋白包括与seq id no:3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，所述cd40l交联抗体的轻链可变区与seq id no:5的氨基酸序列至少95％相同，并且所述cd40l交联抗体的重链可变区与seq id no:7的氨基酸序列至少95％相同；以及向所述受试者施用所述b细胞。
8、在各个实施例中，所述来源是哺乳动物。在各个实施例中，所述cd40l融合蛋白包括seq id no:3的氨基酸序列。在各个实施例中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括seq id no:5的氨基酸序列，所述重链可变区包括seq id no:7的氨基酸序列。在各个实施例中，本发明进一步包括对所述b细胞进行工程化以表达有效载荷、嵌合受体或两者。
9、在各个实施例中，在含有cd40l和cd40l交联抗体的培养基中培养所述b细胞之前，所述b细胞被工程化。在各个实施例中，在含有cd40l和cd40l交联抗体的培养基中培养所述b细胞之后，所述b细胞被工程化。在各个实施例中，本发明进一步包括在存在il-4的情况下培养所述b细胞。在各个实施例中，本发明进一步包括在存在il-21的情况下培养所述b细胞。在各个实施例中，所培养的b细胞表达以下标志物中的至少一种标志物：cd62l、ccr7、cd80、cd86、cd54、icam、cd58或cd27。在各个实施例中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：癌症、心脏疾病、炎性疾病、肌肉萎缩疾病或神经疾病中的至少一种。在各个实施例中，所述癌症是以下中的至少一种：乳腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌；肺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肝细胞癌、间质瘤如gist、胶质母细胞瘤和神经胶质瘤。在各个实施例中，至少约3×107个b细胞被施用于所述受试者。在各个实施例中，所述b细胞群体被培养至少14天。
10、在各个实施例中，本发明涉及一种用于制备工程化b细胞的方法，所述方法包括：从来源获得b细胞群体；在包括cd40l融合蛋白和cd40l交联剂的培养基中培养所述b细胞；以及对所述b细胞进行工程化以表达有效载荷、嵌合受体或两者。在各个实施例中，所述来源是哺乳动物。在各个实施例中，所述来源是包括外周单核血细胞的生物样品。
11、在各个实施例中，所述cd40l融合蛋白包括与seq id no:3至少85％相同的氨基酸序列。在各个实施例中，所述cd40l包括与seq id no:3至少95％相同的氨基酸序列。在各个实施例中，所述cd40l融合蛋白包括seq id no:3融合蛋白的氨基酸序列。在各个实施例中，所述cd40l交联剂是抗体。在各个实施例中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括与seq id no:5至少95％相同的氨基酸序列，所述重链可变区包括与seqid no:7至少95％相同的氨基酸序列。在各个实施例中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括seq id no:5的氨基酸序列，所述重链可变区包括seq id no:7的氨基酸序列。
12、在各个实施例中，在含有cd40l和cd40l交联剂的培养基中培养所述b细胞之前，所述b细胞被工程化。在各个实施例中，在含有cd40l和cd40l交联剂的培养基中培养所述b细胞之后，所述b细胞被工程化。在各个实施例中，所述方法进一步涉及在存在il-4的情况下培养所述b细胞。在各个实施例中，所述方法进一步涉及在存在il-21的情况下培养所述b细胞。在各个实施例中，所培养的b细胞表达以下标志物中的至少一种标志物：cd62l、ccr7、cd80、cd86、cd54、icam、cd58或cd27。在各个实施例中，所述来源是哺乳动物。在各个实施例中，所述来源是包括外周单核血细胞的生物样品。
13、在各个实施例中，所述cd40l融合蛋白包括与seq id no:3至少85％相同的氨基酸序列。在各个实施例中，所述cd40l包括与seq id no:3至少95％相同的氨基酸序列。在各个实施例中，所述cd40l融合蛋白包括seq id no:3融合蛋白的氨基酸序列。在各个实施例中，所述cd40l交联剂是抗体。在各个实施例中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括与seq id no:5至少95％相同的氨基酸序列，所述重链可变区包括与seqid no:7至少95％相同的氨基酸序列。在各个实施例中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括seq id no:5的氨基酸序列，所述重链可变区包括seq id no:7的氨基酸序列。
14、在各个实施例中，所述方法进一步包括在存在il-4的情况下培养所述b细胞。在各个实施例中，所述方法进一步包括在存在il-21的情况下培养所述b细胞。在各个实施例中，所培养的b细胞表达以下标志物中的至少一种标志物：cd62l、cc星空体育 星空体育平台r7、cd80、cd86、cd54、icam、cd58或cd27。在各个实施例中，至少约3×107个b细胞被获得。在各个实施例中，所述b细胞群体被培养至少14天。
15、在各个实施例中，提供了一种制备工程化b细胞的方法，所述方法包括：从来源获得b细胞群体；在包括cd40l和cd40l交联抗体的培养基中培养所述b细胞，其中所述cd40l融合蛋白包括与seq id no:3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，所述cd40l交联抗体的轻链可变区与seq id no:5的氨基酸序列至少95％相同，并且所述cd40l交联抗体的重链可变区与seq id no:7的氨基酸序列至少95％相同；以及向所述受试者施用所述b细胞。在各个实施例中，所述来源是哺乳动物。在各个实施例中，所述cd40l融合蛋白包括seq idno:3的氨基酸序列。在各个实施例中，所述抗体包括轻链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区包括seq id no:5的氨基酸序列，所述轻链可变区包括seq id no:7的氨基酸序列。
16、在各个实施例中，所述方法进一步包括对所述b细胞进行工程化以表达有效载荷、嵌合受体或两者。在各个实施例中，在含有cd40l和cd40l交联剂的培养基中培养所述b细胞之前，所述b细胞被工程化。在各个实施例中，在含有cd40l和cd40l交联剂的培养基中培养所述b细胞之后，所述b细胞被工程化。在各个实施例中，所述方法进一步包括在存在il-4的情况下培养所述b细胞。在各个实施例中，所述方法进一步包括在存在il-21的情况下培养所述b细胞。在各个实施例中，所培养的b细胞表达以下标志物中的至少一种标志物：cd62l、ccr7、cd80、cd86、cd54、icam、cd58或cd27。在各个实施例中，至少约3×107个b细胞被获得。在各个实施例中，所述b细胞群体被培养至少14天。
17、在各个实施例中，本发明涉及一种b细胞扩增培养基，其包括：cd40l融合蛋白和cd40l交联抗体，其中所述cd40l融合蛋白包括与seq id no:3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，所述cd40l交联抗体的轻链可变区与seq id no:5的氨基酸序列至少95％相同，并且所述cd40l交联抗体的重链可变区与seq id no:7的氨基酸序列至少95％相同；以及向所述受试者施用所述b细胞。
18、在各个实施例中，所述cd40l融合蛋白包括seq id no:3的氨基酸序列。在各个实施例中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括seq id no:5的氨基酸序列，所述重链可变区包括seq id no:7的氨基酸序列。在各个实施例中，所述培养基进一步包括il-4。在各个实施例中，所述培养基进一步包括il-21。
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