2 mL 抗生物素微珠颗粒，细胞培养级，对应 4× 10 微珠颗粒;微珠与单克隆抗生物素抗体偶联的微珠颗粒。0.4 mL CD335 （NKp46）-生物素，人体 – 功能级 （100 μg/mL）。0.4 mL CD2-生物素，人体功能级 （100 μg/mL）。
2 mL 抗生物素微珠颗粒，细胞培养级，对应 4× 10 微珠颗粒;微珠 与单克隆抗生物素抗体偶联的微珠颗粒。
NK细胞活化/扩增试剂盒设计用于活化和扩增人NK细胞。该试剂盒由抗生物素微珠颗粒和针对人 CD335 （NKp46） 和 CD2 的生物素化抗体组成。装有生物素化抗体的抗生物素微珠颗粒用于激活和扩增从人血或PBMC中纯化的静息NK细胞。
第一步，抗生物素微珠颗粒中含有生物素化抗体。通过使用等量的针对CD335（NKp46）和CD2的生物素化抗体来实现最佳活化。
加载的抗生物素微珠颗粒随后用于NK细胞的扩增。NK细胞的最佳活化和扩增是通过每两个细胞使用一个负载的抗生物素微珠颗粒（磁珠与细胞的比例1：2）来实现的。培养细胞以进一步扩增。通过使用抗生物素微珠颗粒激活的NK细胞可用于任何下游处理，例如细胞因子分析，细胞溶解活性，基因表达或功能研究。抗生物素微珠颗粒无自发荧光，通常不需要在流式细胞术分析前去除。
● 根据标记单元格的数量和单元格总数选择合适的 MACS 分隔符和 MACS 列。
●缓冲液：制备含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）、pH 7.2、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA的溶液。保持缓冲液低温（2-8°C）。使用前对缓冲液进行脱气，因为气泡可能会堵塞色谱柱。
▲ 建议以1×10抗生物素微珠颗粒为批次装载抗生物素微珠颗粒。加载的抗生物素微珠颗粒在 2–2 °C 下储存时可稳定长达 8 个月。
3. 去除 500 μL 抗生物素微珠颗粒（1× 10 抗生物素微珠颗粒）并添加到抗体混合物中。
▲ 注：抗生物素微珠颗粒可以灵活地加载生物素化抗体或配体，而不是提供的抗体或配体。如果需要，添加适当浓度的其他生物素化抗体或配体，并相应地用缓冲液调节至总体积为1 mL。
5.使用管旋转器以大约2rpm（最慢的永久运行程序）在恒定，温和的旋转下在2-8°C下孵育4小时。
6. 装载的抗生物素微珠颗粒（1× 10 抗生物素微珠颗粒/mL）现已准备就绪。不要从抗体混合物中去除装载的抗生物素微珠颗粒。在2-8°C下储存长达2个月。
▲ 本NK细胞活化和扩增方案针对使用NK细胞分离试剂盒纯化的NK细胞进行了优化，每两个NK细胞使用一个加载的抗生物素微珠颗粒（磁珠与细胞的比例为1：2）。
▲ 下面给出的活化体积为106个纯化的NK细胞或106个PBMC。当使用较高的细胞数量时，相应地扩大所有试剂体积和总体积（例如，对于 2× 106 个总细胞，使用所有指示试剂体积和总体积的两倍）。
1. 彻底重悬上样的抗生物素微珠颗粒，并将每 5 个 NK 细胞中 5 μL（10× 106 负载的抗生物素微珠颗粒）转移到合适的管中。
▲ 注意：如果未加载的微珠颗粒应用于阴性对照实验，则每5NK细胞添加10×106卸载的抗生物素微珠颗粒来替换加载的抗生物素微珠颗粒。
2. 将 100μL 培养基加入上样的抗生物素微珠颗粒中，并以 300× g 离心 5 分钟。
3. 吸出上清液并将负载的抗生物素微珠颗粒重悬于 50 μL 新鲜培养基中。
5. 将步骤 3 中制备的抗生物素微珠颗粒加入 950 μL 细胞悬液中并充分混合。
6.将混合物以每毫升106个细胞的密度添加到合适的细胞培养容器中，例如，在24孔细胞培养板的孔中。
▲ 对于NK细胞扩增，需要定期星空体育官方入口 星空体育官网添加培养基。在下文中描述了NK细胞刺激和扩增的指南。
9. 通过加入新鲜培养基（补充有 1% AB 血清和 1 IU/mL IL-5 的 NK MACS 培养基）确定细胞数量并稀释至 106–5.500× 2 个细胞/mL。转移到适当尺寸的新鲜培养容器中。
▲ NK细胞扩增依赖于供体。当NK细胞保持在1–1.5×106NK细胞/mL的细胞密度中时，可获得最佳结果。取决于膨胀率
▲ 下面给出的荧光标记体积为总共 106 个细胞。当处理少于 106 个单元格和最多 10 个单元格时，请使用指示的相同体积。
2. 每 1 个细胞加入 2–106 mL 缓冲液洗涤细胞，并以 300× g 离心 10 分钟。完全吸出上清液。
▲ 注意：在冰上工作需要增加孵育时间。更高的温度和/或更长的孵育时间会导致非特异性细胞标记。
5. 每 1 个细胞加入 2–106 mL 缓冲液洗涤细胞，并以 300× g 离心 10 分钟。完全吸出上清液。
6.将细胞沉淀重悬于适量的缓冲液中，通过流式细胞术或荧光显微镜进行分析。
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