泛生子依托核心荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）及高通量测序等平台提供分子诊断整体解决方案。“泛谈-分子诊断”专栏旨在与每一位致力于分子诊断应用发展的伙伴共同梳理技术发展脉络、探讨临床转化应用、推动检验发展，为更多病患提供精准诊疗方案。
近期我们梳理了分子诊断技术中测序部分，测序技术根据样本类型不同包含：DNA测序、RNA测序、单细胞测序、甲基化测序等。近期我们将从以下几个方面逐一介绍单细胞测序技术：单细胞测序技术概念及发展历程、单细胞测序技术操作流程、单细胞全基因组测序技术、单细胞全转录组测序技术、单细胞测序技术的应用。
上期我们讨论了单细胞测序技术的概念及发展历程，这期我们将介绍单细胞测序技术流程部分。
与传统混合细胞测序不同的是，单细胞测序起始样本中核酸含量极低，需要对筛选出的细胞扩增后才能满足后期测序实验，目标是在尽量减少序列扩增偏差的前提下增加核酸总量利于后续分析。单细胞测序技术操作流程包括：样本细胞筛选、核酸提取及扩增、测序文库构建、测序和数据分析。
不同类型的样本首先需要通过酶解、机械分解、物理沉淀等方法处理成细胞悬液后再进行单细胞筛选。
A. LCM：激光捕获显微分离；B.显微微管操作法;C.FACS:流式细胞分选;D.MACS:磁珠激活细胞分选;
LCM技术可直接从原生组织中分离出单个细胞，首先将肿瘤组织放置在显微镜载玻片上，通过用热塑性薄膜覆盖目标组织的一部分，并发射激光来熔化薄膜，使其附着在单个肿瘤细胞上，促进该细胞与其邻近细胞的机械隔离。但LCM技术对单个星空体育官方入口 星空体育官网细胞的分离仍有局限：不能完全清除目标细胞表面来自相邻细胞的掺入、污染。[1]
肿瘤组织首先被消化成细胞悬液，借助显微镜通过微管抽吸机械分离单个细胞。此法操作简单、成本较低，但其局限性是费力、效率较低，对识别单细胞时依赖人员的专业知识，易出现操作偏差。[1]
FACS平台通过依靠荧光标记信号结合光散射分析参数，对具有异质性肿瘤组织的单个细胞进行挑选和分析。
与LCM和显微微管分离方法相比，FACS具有更快的分离速度和更高的通量，但此技术的局限性在于分选时需要大量的细胞，同时检测的荧光信号相对较低，低表达的标记物难以或不可能检测到，存在某些特定细胞类型丢失的风险。[1]
MACS依赖细胞表面抗原与磁性颗粒的免疫反应性，能通过磁场有效、快速地分离单个细胞。MACS已成功应用于从不同环境中分离不同表型的单个细胞，特别是用于从外周血中分离循环肿瘤细胞(CTCs)，用于癌症相关的研究。[1]
有限稀释法是通过对细胞悬液进行一系列倍比稀释，使其最终处于单个细胞状态。此法操作简单、成本较低，但其局限性是分离效率较低。
微流控单细胞分离技术即在微米级通道内分离出单个细胞并将其固定在特定位置，以便于进行后续操作与分析检测。大多数微流体设备分离原理大致可分为三种：基于油滴的隔离、气动膜阀和流体动力学细胞陷阱。代表性分离的方法有芯片式微流控和液滴式微流控。[2]
芯片式微流控技术：即芯片上排布大小规则的孔，每个孔的孔径比单细胞直径稍大，可同时放入一个细胞核一个微珠。当细胞悬液经芯片注入孔注入后，会自然沉降到反应孔中。BD公司的RhapsodyTM单细胞测序平台、Fluidiam公司的C1TM单细胞测序平台等均采用此方法。
液滴式微流控技术：即在微米级的管道中，通过两相或多相不相溶液体的力学作用，生成一连串纳升至皮升级均匀的液滴，将单细胞包裹在液滴中。此技术可实现短时间内生成大量单细胞液滴，且每个液滴可作为独立的微反应器，有效避免了交叉污染。10XGenomis公司的Chromium单细胞测序平台等采用此方法。
与传统混合细胞测序不同的是，单细胞测序起始样本中核酸含量极低，需要对筛选出的细胞扩增后才能满足后期测序实验，目标是在尽量减少序列扩增偏差的前提下增加核酸总量利于后续分析。目前主要的单细胞测序扩增方法有：单细胞全基因组扩增和单细胞全转录组扩增。
文库制备包括将扩增产物随机打断成小DNA片段、末端修复、加A、加接头和PCR扩增得到所需文库。单细胞全基因组测序文库是DNA文库，将单细胞DNA纯化后，利用MDA和MALBAC法进行扩增。单细胞转录组测序文库是cDNA文库，从单细胞中获取mRNA后将其反转录成cDNA，之后将cDNA扩增。[3]
NGS技术所具有的测序通量和速度大大提高、测序成本降低的优势，使得该技术在目前全球测序市场上占有重要地位。因此，基于NGS平台的单细胞测序技术作为一种功能强大的工具，可用于研究细胞间的遗传异质性、细胞谱系分化及克隆演化等系列问题。
对单细胞RNA测序数据的分析是扩大该技术在生命和临床科学中的应用的另一个关键因素，为确保单细胞转录组分析工具的可用性，开发人员付出了巨大的努力。到2021年5月28日，已开发出近 1000 种不同的生物信息学工具并可供使用。[5]
单细胞 RNA 测序数据分析可分为：数据预处理（图6蓝色标识）、一般分析（图6绿色标识）、探索性分析（图6黄色标识）。数据预处理包括质量控制、对齐和量化；一般分析包括低质量细胞过滤、归一化、高度可变基因（HVG）选择、降维、细胞类型的聚类和注释；探索性分析包括差异表达基因（DEG）分析、功能富集、基因集变异分析（GSVA）、TF预测、细胞轨迹、细胞间相互作用、细胞周期和空间转录组分析。[5]
接下来文章我们将介绍单细胞测序技术中全基因组测序、全转录组测序部分，敬请期待！
[3]高山凤，肖轩等，单细胞测序技术在生殖研究中的应用[J].中国细胞生物学学报，2020,42(12)：2234-2243。
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