与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模 板准确定量，无法对扩增反应实时检测
假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一
将温度与荧光强度的变化求导didt原始图谱对数图谱sybrgreen融解曲线融解曲线分析单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析出现杂峰其他产物出现非特异性荧光因此定量不准确sybrgreendna模板没有选择性适用于任何dna使用方便不必设计复杂探针容易与非特异性双链dna结合产生假阳性但可以通过融解曲线的分析优化反应条件sybrgreen优缺点taqman端标记有报告基团reporter端标记有荧光淬灭基团quencher外切核酸酶活性可水解探针taqman工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针dna聚合引物探针的设计
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203） 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA；
以上条件不可能同时得到满足，必须用 内对照基因（管家基因）进行校正，进 行相对表达量分析。
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等
手动设置：大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段
35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30Cycles 内无非特异性产物扩增
荧光定量PCR原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲星空体育网站 星空体育首页线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果星空体育网站 星空体育首页可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。
问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家 基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对 表达量。
修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么 2－△△Ct可以修正为：E－△△Ct，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95－△△Ct
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM
PCR扩增过程中，扩增 产物的荧光信号达到设 定的阈值时所经过的扩 增循环次数
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。
容易与非特异性双链DNA结合， 产生假阳性 但可以通过融解曲线 的分析，优化反应条件
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
△Ct（处理前）＝18－17＝1 △Ct（处理后）＝16－17.4=－1.4 △△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－1.4－1＝－2.4
绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量， GMO定量检测等 相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯 片结果验证，差异显示结果验证等
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实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩 增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进 行定量分析