据报道，多种细胞因子组合被广泛应用于NK细胞的体外扩增。IL-2和IL-15的联合应用已经作为体外扩增NK细胞的经典方案，IL-2是重要的诱导NK细胞增殖的星空体育网站 星空体育首页细胞因子，通过激活各种激酶通路，增加NK细胞活性，促进NK细胞增殖；IL-15可以上调NK细胞表面受体的表达，同时促进CD56+细胞的扩增。除此之外，近年来发现其它细胞因子同样可以调节NK细胞的活性以及分化。IL-12 p70可以诱导激活，刺激细胞毒杀伤以及INFγ和TNF的产生； IL-7可以促进NK细胞分化和诱导产生细胞毒性淋巴细胞的标志蛋白；IL-18能够上调NK细胞的细胞毒性，从而提高NK细胞的杀伤活性。通常，使用RPMI1640添加细胞因子进行NK细胞的体外扩增，但是，不同细胞因子组合，对于NK细胞体外扩增会有不同的影响，对K562细胞的杀伤也有着明显的差异。因此对于同一个实验，不同的的细胞因子组合会导致实验重复性差，而且添加细胞因子也相对费力。而无需额外添加细胞因子的完全培养基可完美克服这些缺点。
2.加入1% NK细胞培养添加物到NK细胞基础培养基中。例如，在100 mL基础培养基中加入1 mL添加物。
注意：仅仅准备3周的用量即可。完全培养基储存在2-8℃时最多可用3周。不要冻存。
原理：乙酸破坏红细胞和白细胞的细胞膜，而白细胞的细胞核被染成蓝色，通过对细胞核计数，确定有核细胞数量。3%乙酸溶液将破坏细胞膜，同时保留完好的细胞核。亚甲基蓝染色将使细胞核更容易观察。应在细胞加在乙酸溶液中约10分钟内进行有核细胞的计数。
i.用含有3%乙酸的亚甲基蓝稀释20 μL样本。（将骨髓、脐血、动员后外周血来源的MNC稀释50到100 倍，外周血来源的稀释20到40倍。如果有核细胞数量较高，可能需要更高的稀释倍数）。
例如：对于50 倍稀释，将20μL 细胞加入980 μL 含亚甲基蓝的3%乙酸中。
iii.用酒精清洗计数池和盖玻片，然后用无屑纸巾擦干，准备血细胞计数板。
vi. 从血细胞计数板的一个计数池开始，使用手持式计数器或类似设备计数至少两对角1 mm 方格中的有核细胞。计数另一对角计数池相同数量的方格。如果细胞在边缘，采用计下不计上，计左不计右原则。记录细胞总数并计算每个方格的平均数。如果方格的细胞数不足10个，应制备浓度更高的悬液。
图1Neubauer 血细胞计数板。九个大方格的边长都是1 mm，深度为0.1 mm。
vii.血细胞计数板盖玻片覆盖的位置有9个方格，总体积为0.1 mm3(或10-4cm3，相当于10-4mL )，试用下列公式计算细胞总数：
2.用5-10倍体积的完全培养基清洗细胞，300x g离心10分钟。弃上清。
ii.如果细胞密度小于1×106细胞 /mL，添加足够的新鲜NK扩增培养基。
iii.如果细胞密度大于1×106细胞 /mL，添加足够的新鲜NK扩增培养基稀释细胞至星空体育网站 星空体育首页细胞浓度到4–5×105细胞/mL（例如，如果第7天的时候细胞密度为1.5×106细胞/mL，在现有的250 μL培养体系里加入500 μL新鲜培养基，使总体积达到750μL，细胞密度为5×105细胞/mL）。
ii.细胞中加入足够量的新鲜NK细胞培养基使细胞密度为4–5×105细胞/mL.
ii.细胞中加入足够量的新鲜NK细胞培养基使细胞密度为4–5×105细胞/mL.
图3 NK细胞的扩增可以以PBMC为起始细胞或者直接用分离的NK细胞作为起始细胞。使用NK MACS扩增培养基扩增NK细胞的效率其它培养基的3倍。
[5.王晓梦，李玲，于津浦, 等。四种NK细胞体外扩增方案及其杀伤活性的比较.中国肿瘤生物治疗杂志，2013，20（3）