1.一种CD8 T细胞的扩增培养方法，其特征在于，在下列物质的存在下，诱导扩增培养
CD137L的K562工程细胞，用于提供激活CD8 T细胞的共刺激受体第2信号；将K3EC细胞与外
周血单个核细胞共培养；所述外周血单个核细胞与K3EC细胞共培养的比例在20:1到5:1之
（2）美天旎，货号130‑093‑435的巨细胞病毒‑pp65蛋白的肽段，用于提供激活CD8T细胞
（3）在扩增培养抗原特异性CD8 T细胞时，补充细胞因子作为CD8 T细胞增殖的第3信
2.如权利要求1所述的CD8 T细胞的扩增培养方法，其特征在于，还包括以下步骤，采用
多聚甲醛固定K3EC细胞；然后分选富集均质性CD8 T细胞，再培养扩增CD8 T细胞至需要的
3.一种CD8 T细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述培养方法包括步骤：
（2）将K3EC细胞与外周血单个核细胞共培养；所述K3EC细胞为表达CD2配体CD58、NKG2D
（3）步骤（2）共培养同时，采用美天旎，货号130‑093‑435的巨细胞病毒‑pp65蛋白的肽
（4）T细胞通过步骤（2）和步骤（3）扩增培养时，补充细胞因子作为CD8 T细胞增殖的第3
（5）采用多聚甲醛固定K3EC细胞，然后组织分选富集均质性CD8 T细胞；
4.如权利要求3所述CD8 T细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞
5.如权利要求3所述CD8 T细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞
6.如权利要求3‑5之一所述CD8 T细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述培养方法还
7.如权利要求6所述CD8 T细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述质量检验为：
8.如权利要求6所述CD8 T细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述质量检验还包括检
9.如权利要求7所述CD8 T细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述质量检验还包括检
细胞通过T 细胞受体(T cell receptor，TCR)特异性识别抗原，这种抗原以具有免疫原性
CMV和EB病毒等) 和恶性肿瘤(如黑色素瘤等)得到控制，取得明显的临床疗效。而采用基因
工程技术构建TCR 表达载体后制备遗传改造的表位特异性TCR‑T细胞，目前也正在临床试
验，这种新颖的T细胞治疗被誉为是引领肿瘤治疗发展的一个前沿领域，受到了肿瘤医药界
需要通过一个高效的扩增平台(expansion platform)才能获得足够的T细胞用于临床治
疗。这个平台主要提供二项技术支撑，一是按照GMP标准实现T细胞的规模化培养扩增；二是
避免T 细胞在快速增殖的同时发生终未分化而成为效应T细胞(effector T cells，T
在这二项技术支撑中，控制细胞分化显得更为重要，因为T细胞输注后植入体内长期生存并
细胞样特性(如自我更新等)、再次遭遇相应抗原时能够被迅速激活并引起效应程度更强的
切相关，而在基因表达水平，CD27和CD127表达是T细胞输注后能够长期生存的重要标志。
机制的精细调控。这种自稳增殖无需抗原特异性TCR信号，细胞因子受体第3信号起着关键
从体液或组织中规模化制备抗原特异性CD8 T细胞的一个主要技术障碍是获得足
一次性采血300–600ml)才能满足DC制备的需求。显然，如此规模的采血量在临床上难度较
大，患者也不易接受。因而寻找适当的APC(DC)替代方案高效扩增抗原特异性 T细胞，是当
因此，本领域迫切需要开发出新的更为有效的抗原特异性CD8 T细胞的扩增培养
本发明提供一种抗原特异性CD8 T细胞的扩增培养方法，同时提供一种K3EC细胞。
本发明第一发明，提供一种抗原特异性CD8 T细胞的扩增培养方法，即在下列物质
CD137L的K562工程细胞，用于提供激活CD8 T细胞的共刺激受体第2信号；
(2)靶标抗原的肽段重叠文库，用于提供激活CD8T细胞的TCR第1信号。
优选的，在扩增培养抗原特异性CD8 T细胞时，补充细胞因子作为CD8 T细胞增殖
上述方法还包括以下步骤，采用多聚甲醛固定K3EC细胞；然后分选富集均质性CD8
本发明第二发明提供一种抗原特异性CD8 T细胞的扩增培养方法，所述培养方法
(2)将K3EC细胞与外周血单个核细胞共培养；所述K3EC细胞为表达CD2配体CD58、
(3)步骤(2)共培养同时，采用巨细胞病毒‑pp65蛋白的全蛋白肽段重叠文库激活
(4)T细胞通过步骤(2)和步骤(3)扩增培养后，补充细胞因子作为CD8 T细胞增殖
(5)采用多聚甲醛固定K3EC细胞，然后组织分选富集均质性CD8 T细胞；
检测所述CD8 T细胞特性，包括检测细胞组份(TSCM/CM)、抗原特异性应答能力
本发明第三方面，提供上述抗原特异性CD8 T细胞的扩增培养方法获得的抗原特
本发明第四方面，提供一种K3EC细胞，其特征在于，所述K3EC细胞为K562工程细
本发明专利介绍了一种基于MLPC‑plus的快速扩增平台，具有以下特征：
1 .绕过APC加工递呈肽段表位这个环节，直接激活PBMC中的抗原特异性CD8 T细
的一种APC 替代方案。在MLPC过程中，肽段表位嵌入PBMC表面相应MHCI中形成pMHC，后者即
可被CD8 T表面的特异性TCR识别并转导激活信号。这种抗原递呈方式称为交叉递呈(cross
presentation)，其特征是无需APC进行细胞内抗原加工过程而直接激活相应TCR。但由于绕
过了APC加工递呈肽段表位这个环节，MLPC激活CD8 T细胞时通常缺乏足够的共刺激信号，
death， AICD)。为了补充在MLPC中CD8 T细胞激活所需要的共刺激信号，本专利采用基因工
2.具备快速形成均质性CD8 T细胞群的能力。通过MLPC‑plus技术激活T细胞后，进
一步从增殖细胞中富集目标细胞群，能够在3周内从20ml外周血样中获得108量级、均质性
3.添加IL15及低剂量IL2提供第3信号促使TSCM/CM形成。抗原激活CD8 T细胞后需
要提供IL15和IL2第3信号才能高效扩增。上述细胞因子分别通过特异性受体激活JAK‑
STAT5 信号通路发挥作用，但IL15受体和IL2受体信号产生的免疫学效应不一样，IL2与其
受体结合促使CD8 T细胞增殖并分化成为TEFF，而IL15与其受体结合主要是维持TM的自稳
增殖。 IL2和IL15的作用差异在于IL2对PI3K‑AKT信号通路的刺激活性明显高于IL15，其中
AKT激活时，FOXO1 和FOXO3a被磷酸化修饰后从核内转位到胞浆内并被蛋白酶体
4.抗原特异性免疫应答能力强。CD8 TSCM/CM的特征是在相应抗原表位激活后能
够分泌 IFN等细胞因子并通过快速增殖分化形成TEFF发挥效应功能。采用IFN俘获试验进
行检测，证明CMV‑pp65抗原刺激后的IFN分泌量与多克隆的CD3抗体刺激相等(按ASR计算平
T细胞中存在1个或多个细胞克隆，这些T细胞克隆能够识别不同的HLA‑A和/或HLA‑B 位点
所递呈的抗原表位。鉴定这些特异性T细胞识别的抗原表位及其HLA递呈位点有助于选择具
备上述位点的疾病(如白血病)患者进行有针对性的输注治疗，从而为实施精准免疫治疗
分选富集采用磁性细胞分选(MACS)获得CD8 T细胞，后者扩增达到10
FCM检测K3EC细胞表面经慢病毒转染导入的CD64(上排中)和CD137L(上排右)，并
以同型对照抗体染色(上排左)作为对照。该细胞表面也检测到MICA/B(下排中)和CD58 (下
排右)，而HLA‐ABC微量表达(下排左)。横坐标系导入的GFP示踪蛋白，纵坐标为待检抗体的
采用竞争结合试验法检测人源化的CD3抗体(IgG1)对鼠源CD154荧光抗体
CD137L(中排右)均呈检测阳性。当加入10倍过量的CD3抗体时，CD154(下排左) 检测阳性率
显著降低，但不影响CD58(下排中)和CD137L(下排右)检测结果。横坐标系导入的GFP示踪蛋
PBMC经CFSE荧光染色后加入CD3抗体作为TCR第1信号，然后添加不同比例K3EC 提
供共刺激第2信号(PBMC：K3EC比例分别为5:1、10:1和20:1)，培养2天及5天时收集细胞，其
中检测组加入CD3荧光抗体染色T细胞，对照组不加荧光抗体。横坐标系CFSE 信号，纵坐标
为CD3抗体荧光信号，T细胞增殖后CD3检测阳性但CFSE信号减弱，此类增殖细胞占比见图左
CMV呈二十面体蛋白衣壳结构，内含双链DNA病毒基因组。衣壳由球状的脂质膜包
pp65是CMV最主要的结构蛋白，也是病毒颗粒中含量最高的一种体星空体育网站 星空体育首页被蛋白。pp65全
蛋白的肽段重叠文库含138个肽段，每个肽段长度15个氨基酸，相邻肽段之间11个氨基酸序
PBMC中加入20％K3EC(提供共刺激第2信号)后分组，阳性对照组(P)星空体育网站 星空体育首页添加CD3抗体，
获抗体将分泌在上清中的IFNγ锚定到细胞表面，PBS淋洗后用IFNγ荧光抗体检测阳性细
上述标志双阳性细胞(见图右上角)，此类细胞负载肽段表位后具有APC功能。
的检测结果，中排为MLPC‑plus培养后的检测结果，下排为MACS 富集CD8 T细胞后的检测结
MACS富集的CD8 T细胞中加入20％K3EC(提供共刺激第2信号)后分组，阳性对照组
(P)添加CD3抗体，实验组(E)分别添加CMV‑pp65肽段文库以及10个HLA位点特异性肽段表
位，阴性对照组(N)不添加TCR第1信号。培养24hr后FCM检测IFNγ