（1）培养瓶包被：用含肝素钠、CD16和人免疫球蛋白的包被液铺满非TC处理的T75培养
瓶的底部，将培养瓶置于4℃冰箱静置；8‑12小时后吸弃培养瓶内液体，并用PBS洗涤培养瓶
（3）血浆的灭活：将外周血放入离心机离心，获得上层血浆和下层血液，取上层血浆在
56℃下灭活30min，将灭活血浆离心10min，弃去底部血小板及补体，获得自体血浆，置于4℃
（4）单个核细胞的分离：用生理盐水调整下层血液的细胞密度，提前在50ml离心管中加
入淋巴细胞分离液，将调整好密度的血液缓慢加入分离液上；将50ml离心管放入离心机，设
置离心力为800g，升降档调至0‑1档，离心30‑40min，吸取单个核细胞层于50ml离心管中，加
10ml无血清完全培养基培养，其中含有步骤（3）的自体血浆、IL‑2、IL‑15和IL‑18，放入37
（6）扩增：经过3天的静置培养，根据细胞的生长情况补加新鲜的无血清完全培养基或
者只补加自体血浆和IL‑2、IL‑15、IL‑18因子，确保细胞密度在0.8×10
（7）转瓶：当细胞数量过多时，把细胞转移到没有被包被过的T225培养瓶中，每2～3天
步骤（1）中包被液中肝素钠含量为500U/ml、CD16含量为5ug/ml、人免疫球蛋白为1mg/
步骤（5）无血清培养基中自体血浆、IL‑2、IL‑15和IL‑18的含量分别为2.5wt.%
本发明涉及人类细胞培养技术领域，尤其涉及一种NK细胞体外培养扩增的方法。
NK细胞，又称自然杀伤细胞，是人体内一种重要的天然免疫系统淋巴细胞。其表型
瘤细胞，在机体抗肿瘤及早期抗病毒等免疫应答中起着重要作用。因此，NK细胞对肿瘤病人
的治疗有很大的前景，但是NK细胞在体内所占的比例低、数量少，限制了NK细胞的应用，所
目前体外扩增NK细胞的技术主要有三种：一是采用免疫磁珠细胞分选，从外周血
单个核细胞得到纯化的NK细胞，在体外加入因子扩增培养；二是利用滋养层细胞K562细胞
扩增原代NK细胞；三是直接利用因子刺激从外周血中扩增培养NK细胞。前两种扩增NK细胞
的方法在临床上应用的安全性尚未得到验证，且K562细胞作为肿瘤细胞存在一定的风险，
因此这两种方法多用于科研研究。第三种利用因子刺激扩增培养NK细胞的方法安全性较
好，临床应用价值高，但扩增倍数和纯度不高且不稳定。因此，寻找一种安全性好、扩增倍数
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种扩增方法简单、高效，有利于规
一种NK细胞体外扩增培养的方法，其创新点在于：无需滋养层细胞，利用含有肝素
钠、CD16和人免疫球蛋白包被液包被培养瓶，激活NK细胞，通过IL‑2、IL‑15和IL‑18多种纯
（1）培养瓶包被：用含有肝素钠、CD16和人免疫球蛋白的包被液铺满非TC处理的
T75培养瓶底部，将培养瓶置于4℃冰箱静置。8‑12小时后吸弃培养瓶内液体，并用PBS洗涤
培养瓶2遍，用于以下操作。包被液中肝素钠含量为500U/ml、CD16含量为5ug/ml、人免疫球
（2）外周血采集：志愿者检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒
抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒IgM抗体等项目均为阴性。抽取50ml外周血，置于10ml无
（3）血浆的灭活：将外周血放入离心机离心，转速为3000rpm，时间10min。获得上层
血浆和下层血液，取上层血浆在56℃温度下灭活30min，将灭活血浆在离心力为3000g的条
件下离心10min，弃去底部血小板和补体，获得自体血浆，置于4℃无菌保存。
在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，将上述调整细胞密度的血液缓慢加入分离液上，可
用移液管嘴在离心管壁小心划出几条通道，保证血液平稳的平铺在分离液上；将50ml离心
管放入离心机，设置离心力为800g，升降档调至0‑1档，离心30‑40min，吸取单个核细胞层于
50ml离心管中，加入生理盐水30～40ml，混匀置于离心机中，离心力300g，离心10min，弃上
清液，重复洗涤2～3次。淋巴细胞分离液与血液的体积比例为1:1～1:3。
10ml无血清完全培养基培养，其中含有步骤（3）的自体血浆、IL‑2、IL‑15和IL‑18。放入37
培养箱培养。无血清完全培养基中自体血浆、IL‑2、IL‑15和IL‑18的含量分别为
（6）扩增：经过3天的静置培养，根据细胞的生长情况补加新鲜的无血清完全培养
基或者只补加自体血浆和IL‑2、IL‑15、IL‑18因子，确保细胞密度在0 .8×10
（7）转瓶：当细胞数量过多时，把细胞转移到没有被包被过的T225培养瓶中，及时
（8）细胞的收获和检测：连续培养细胞14～18天之后，收获细胞，并取出一部分用
本发明的提供的NK细胞培养方法安全性高，NK细胞经过培养激活后，扩增能力强，
经过14～18天的培养，扩增倍数可达180～250倍，经流式细胞仪检测，NK细胞所占的比例在
图3为实施例1 NK细胞培养前细胞表型的流式图；CD3带FITC荧光，CD16带PE荧光，
图4为实施例1 NK细胞培养后的细胞表型的流式图； CD3带FITC荧光，CD16带PE荧
一种NK细胞体外培养的方法，经过培养瓶Coating、外周血采集、血浆的灭活、单个
（1）培养瓶Coating：将肝素钠、CD16和人免疫球蛋白配置成混合溶液，其中肝素钠
的T75培养瓶的底部，将培养瓶置于4℃冰箱静置。12小时后吸弃培养瓶内液体，并用PBS洗
（2）外周血采集：志愿者检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒
抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒IgM抗体等项目均为阴性。抽取50ml外周血，置于10ml无
（3）血浆的灭活：将外周血放入离心机离心，转速星空体育网站 星空体育首页为3000rpm，时间10min。获得上层
血浆和下层血液，取上层血浆在56℃温度下灭活30min，将灭活血浆在离心力为3000g的条
（4）单个核细胞的分离：将生理盐水补加入下层血液中，调整细胞密度为5×10
ml。提前在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，将上述调整细胞密度的血液缓慢加入分离
液上，可用移液管嘴在离心管壁小心划出几条通道，保证血液平稳的平铺在分离液上。将
50ml离心管放入离心机，设置离心力为800g，升降档调至0档，离心30min。吸取单个核细胞
层于50ml离心管中，加入生理盐水30ml，混匀置于离心机中，离心力300g，离心10min，弃上
清液，重复洗涤3次。取一部分细胞用于做流式检测及细胞计数，流式结果见图3。淋巴细胞
10ml无血清完全培养基培养，其中含有10wt .%的步骤（3）的自体血浆、1000U/ml IL‑2、
（6）扩增：经过3天的静置培养，根据细胞的生长情况补加新鲜的无血清完全培养
基（除自体血浆含量调整为2.5%外，其他配方不变星空体育网站 星空体育首页），确保细胞密度在1×10
（7）转瓶：当细胞数量过多时，把细胞转移到没有被包被过的T225培养瓶中，及时
（8）细胞的收获和检测：连续培养细胞14天，在第14天收获细胞。将所有的细胞置
于250ml锥形离心管内离心，500g，离心15分钟。将细胞转移至一瓶离心管内，补加生理盐水
洗涤细胞，重复操作3遍。取出一部分用于细胞计数和流式细胞分析，细胞收获总数为4.4×
（1）培养瓶包被：用含有肝素钠、CD16和人免疫球蛋白的包被液铺满非TC处理的
T75培养瓶底部，将培养瓶置于4℃冰箱静置。10小时后吸弃培养瓶内液体，并用PBS洗涤培
养瓶2遍，用于以下操作。包被液中肝素钠含量为500U/ml、CD16含量为5ug/ml、人免疫球蛋
（2）外周血采集：志愿者检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒
抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒IgM抗体等项目均为阴性。取50ml外周血，置于10ml无菌
（3）血浆的灭活：将外周血放入离心机离心，转速为3000rpm，时间10min。获得上层
血浆和下层血液，取上层血浆在56℃温度下灭活30min，将灭活血浆在离心力为3000g的条
件下离心10min，弃去底部血小板和补体，获得自体血浆，置于4℃无菌保存。
中加入淋巴细胞分离液，将上述调整细胞密度的血液缓慢加入分离液上，可用移液管嘴在
离心管壁小心划出几条通道，保证血液平稳的平铺在分离液上；将50ml离心管放入离心机，
设置离心力为800g，升降档调至0档，离心40min，吸取单个核细胞层于50ml离心管中，加入
生理盐水40ml，混匀置于离心机中，离心力300g，离心10min，弃上清液，重复洗涤2次。淋巴
10ml无血清完全培养基培养，其中含有步骤（3）的自体血浆、IL‑2、IL‑15和IL‑18。放入37
培养箱培养。无血清完全培养基中自体血浆、IL‑2、IL‑15和IL‑18的含量分别为
（6）扩增：经过3天的静置培养，根据细胞的生长情况，补加新鲜的无血清完全培养
（7）转瓶：当细胞数量过多时，把细胞转移到没有被包被过的T225培养瓶中，及时
（8）细胞的收获和检测：连续培养细胞18天之后，收获细胞，并取出一部分用于细