导航：X技术最新专利有机化合物处理,合成应用技术双阴性t细胞的转化扩增方法
，中下为c组，右图为b组。4天后分裂增殖分裂的⑶4T细胞占⑶4T细胞总数的46.4%。如果培养中加入a组体外扩增的WT小鼠的DNT细胞(DN T细胞数量为起始CD4T细胞数量的1/4)，可以明显抑制CD4T细胞的分裂增殖，分裂⑶4T细胞的百分比下降到11.6(对⑶4T细胞的抑制率为75% )。加入b组体外转化的WT小鼠的DN T细胞，可以明显抑制⑶4T细胞的分裂增殖，分裂⑶4T细胞的百分比下降到13.4 (对⑶4T细胞的抑制率为71 %)。而如果DN T细胞来源于加入0X40激活剂0X86的培养环境(c组)，可以进一步加强DN T的免疫抑制功能，分裂⑶4T细胞的百分比下降到2.94(抑制率达到93% )。发明人利用实施例1、3及4重复上述实验，对CD4T细胞的抑制率与实施例2相似，在此不赘述。
[0084](3)由于穿孔素(Perforin)的表达对DN T的免疫调节功能至关重要，所以对不同条件扩增的DN T细胞的Perforin表达进行了分析。首先提取上述4种不同培养条件下获得的DN T细胞，提取总RNA，进行荧光PCR检测Perforin表达。实验证实，在培养转化DN T的体系中，激活0X40(加入0X86)可以上调DN T的Perforin的表达，从而导致DN T的免疫抑制功能进一步加强，如图12所示。发明人利用实施例1、3及4重复上述实验，对Perforin表达结论与实施例2相似，在此不赘述。
[0085]实施例10实施例2方法体外获得的DNT细胞对肝脏免疫损伤具有保护作用。
[0086](1)实施例2方法培养DN T细胞对肝脏免疫损伤的体外保护实验:提取C57BL/6小鼠的肝脏细胞以及脾脏细胞，将两种细胞按1: 1混合培养，并应用ConA( 10ug/ml)刺激4小时(培养选择1640培养基+10%胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素)后，收集培养的肝细胞进行Annexin V染色，评价肝细胞的免疫损伤情况。如图13所示，ConA可以诱导淋巴细胞对肝细胞的免疫损伤，肝细胞的凋亡由17 %上升到54.6 %，而加入上述方法扩增转化后的DN T细胞后可以明显抑制淋巴细胞对肝脏的免疫损伤，肝细胞凋亡星空体育网站 星空体育首页率下降至34.8%。发明人利用实施例1、3重复上述实验，实验结果与实施例2相似，在此不赘述。
[0087](2)实施例2方法培养DN T细胞对肝脏免疫损伤的体内保护实验:肝脏免疫损伤涉及多种肝脏疾病(如病毒性肝炎、自身免疫性肝脏疾病等)。利用ConA静脉注射(10mg/kg)可以造成小鼠免疫性肝脏损伤坏死，是模拟人免疫性肝损伤的经典模型。在给小鼠注射ConA之前，给予上述方法体外扩增转化的DN T细胞IX 106，即可显著减轻肝脏的免疫损伤和坏死，如图14所示，左图为正常小鼠肝脏组，中图为ConA静脉注射组(可见明显的桥接坏死灶)，右图为DN T细胞预防+ConA静脉注射(无明显肝脏坏死表现)。如图15所示，DN T细胞可以显著降低转氨酶水平。发明人利用实施例1、3重复上述实验，实验结果与实施例2相似，在此不赘述。
[0088]实施例11实施例4方法获得的DN T细胞体外实验证实其可以明显的抑制⑶3T细胞的分裂增殖，从而达到抑制免疫反应的作用
[0089](1)按照实施例4的方法获得DN T细胞。上述方法获得的DN T细胞表型为⑶3+⑶4一⑶8TD56—，收获细胞纯度95%。
[0090](2)体外抑制实验:抽取人外周静脉血，经淋巴细胞分离液进行梯度离心，分离外周血单个核细胞(PBMC)。将PBMC进行CFSE染色标记，利用CD3抗体(5ug/ml)与CD28抗体(5u星空体育网站 星空体育首页g/ml)体外刺激增殖，培养选择XVIV0无血清培养基+长效谷氨酰胺+庆大霉素。培养同时加入相同数量的DN T细胞，共同培养3天后，收集细胞，进行CD3染色，分析CFSE标记的CD3T细胞的体外分裂增生能力。图16可见，体外扩增转化的DN T细胞可以将CFSE标记的CD3T细胞的增殖比率由80.7%降至14.6%，达到很好的免疫抑制功能。
1.一种双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于包括如下步骤: (1)提取起始样品中的单个核细胞，去除该单个核细胞中的CD8+T细胞和NK细胞； (2)将步骤(1)得到的样品在体外用包含T细胞刺激剂及细胞因子的培养基中培养;在培养过程中同时加入0X40的激活抗体或0X40的配体； (3)培养5?7天后，提纯双阴性T细胞。2.如权利要求1所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)中起始样品为小鼠源或人源的含有双阴性T细胞或者其前体的生物学样品。3.如权利要求2所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述生物学样品为外周血、骨髓、淋巴组织、胸腺、肝或脾。4.如权利要求1所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)中的T细胞刺激剂为树突状细胞、B细胞、刀豆球蛋白A、植物凝集素、PMA、钙离子载体、IPP、帕米膦酸、唑来膦酸、⑶3抗体和⑶28抗体中的一种或多种。5.如权利要求4所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，当使用树突状细胞和/或B细胞作为T细胞刺激剂时，其与样品细胞的比率为1:1?1:4。6.如权利要求4所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，当使用刀豆蛋白A、植物凝集素、PMA、钙离子载体、IPP、帕米膦酸和唑来膦酸中的一种或多种作为T细胞刺激剂时，用量为2?10ug/ml。7.如权利要求4所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，当使用CD3抗体作为T细胞刺激剂时，用量为1?5ug/ml。8.如权利要求4所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，当使用CD28抗体作为T细胞刺激剂时，用量为0.5?2ug/ml。9.如权利要求1所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)中的细胞因子为IL-2、IL-15、IFN-r和TNF-a中的一种或多种。10.如权利要求9所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述细胞因子的用量为 20 ?200ng/ml。11.如权利要求1所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)中的0X40的激活抗体为0X86，0X40的配体为0X40L。12.如权利要求11所述的双阴性T细胞的扩增方法，其特征在于，所述0X40激活抗体0X86 的用量为 10 ?100ug/ml，0X40L 的用量为 20 ?200ug/ml。13.如权利要求1所述的双阴性T细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤(3)中提纯方法为:收获培养的细胞，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得双阴性T细胞。14.如权利要求1至13中任意一项所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，起始样品为小鼠源时得到的双阴性T细胞的表型为CD3+CD4—CD8—NK1.1—;起始样品为人源时得到的双阴性T细胞的表型为CD3+CD4—CD8—CD56—。15.权利要求1至13中任意一项所述方法获得的双阴性T细胞群在制备用于移植排斥、自体免疫紊乱、移植物抗宿主病、对肿瘤细胞的应答、对感染的应答或对变态反应原的应答药物中的用途。16.权利要求1至13中任意一项所述方法获得的双阴性T细胞群在制备用于免疫性肝损伤的预防及治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种双阴性T细胞的转化扩增方法，包括如下步骤：(1)提取起始样品中的单个核细胞，去除该单个核细胞中的CD8+T细胞和NK细胞；(2)将步骤(1)得到的样品在体外用包含T细胞刺激剂及细胞因子的培养基中培养；在培养过程中同时加入OX40的激活抗体或OX40的配体；(3)培养5～7天后，提纯双阴性T细胞。本发明无需提纯CD4+T细胞或天然DN？T细胞即可实施，降低了操作难度，增加了操作效率。培养周期短。本发明可有效降低DN？T细胞在扩增中的凋亡率，同时增强其免疫抑制功能。DN？T细胞的收获率较之现有技术有极大的提升。本发明获得的DN？T细胞具有显著的免疫抑制功能，分裂增殖的CD4T细胞的百分比较之现有技术下降到2.94％，抑制率可达到93％。
【发明人】张栋, 李新民, 赵新颜, 孙广永, 刘锴, 田丹, 田月, 施文, 孙晓静, 许虎峰