由健康供体细胞大批量生产的同种异体细胞疗法有可能解决与自体细胞疗法相关的许多物流和生产挑战。然而，它们面临着自己的生产障碍，包括需要产生大量同质细胞群，同时保持功能并避免表型差异。行业正在探索几种策略来解决这些问题，同时确保开发具有成本效益的工艺，并简化开发和生产时间表。
所有同种异体细胞疗法，无论细胞类型如何，是否经过基因改造，都面临一些根本性的挑战。这些挑战包括采购足够、合适的细胞、获得适合用途的试剂和生产系统，以及上游、下游、灌装/完成和冷冻保存过程的可放大性。
与使用来自接受治疗的患者的细胞的自体疗法不同，同种异体疗法是利用不相关的健康供体组织（例如骨髓或淋巴细胞，包括自然杀伤（NK）细胞和 T 细胞）大批量生产的。突破性药物中心细胞治疗工艺开发总监 Nikhil Tyagi 指出：“这种方法使同种异体疗法更具吸引力，但也带来了与从不同捐赠者获取和处理细胞相关的新复杂性，可能会引发受体体内的免疫反应。” 。他补充说，来自不同供体的细胞具有不同的扩增倾向，因此产量也不同。
突破中心细胞治疗、药品和工艺分析工艺开发主管 Tatiana Nanda 指出，细胞疗法开发人员还必须使用尚未针对同种异体产品的开发和生产完全优化的大规模生产技术。“需要在细胞培养基和生产设备等领域进行创新，以提高工艺的效率、安全性和产量，”她认为。此外，Nanda 认为，优化培养条件、培养基、生长因子和实施自动化生产工艺对于应对这一挑战是必要的。
扩大细胞生产规模，特别是贴壁细胞生产规模，提出了另一个挑战。“当前的扩增方法通常依赖于不易放大的劳动密集型和手动工艺。开发能够生产足够数量的细胞的稳健、高效的生产工艺是当今世界的关键要求。”Tyagi 说。
Nanda 表示，即使在可以实现大规模同种异体细胞扩增的情况下，有效收获大量细胞仍然存在限制。她还指出需要超快速灌装/完成、贴标和目视检查流程，而这些流程通常仅限于 30-180 分钟的时间窗口。“高通量灌装/完成和自动视觉检查功能可以解决这些瓶颈，”她说。用于大规模、机器人冷冻保存的定制解决方案也有助于冷冻保存大批量的同种异体药物产品。
捐赠的细胞起始材料的质量和组成/可变性在同种异体细胞治疗中至关重要。“这些因素可以显著影响大规模细胞扩增的成功或失败，”Tyagi 说道。
捐赠细胞的质量直接影响同种异体细胞疗法的安全性和有效性，因为质量差的细胞可能无法按预期发挥作用，从而导致治疗结果不佳。此外，Tyagi 还观察到，筛选不当的细胞可能会传播传染病。
同时，细胞材料的组成可以显著影响治疗效果，因为不同的细胞类型具有不同的作用和功能。“例如，”Tyagi 说，“某些细胞类型的存在或缺失，例如造血干细胞移植中的 T 细胞，可能会导致并发症或产生有益效果。” 与此同时，供体之间和供体内部的差异性也会影响同种异体细胞疗法的一致性。
Tyagi 表示，捐赠后处理细胞（分离、纯化和储存）的方法也会影响其质量和功能，包括其活力和治疗潜力。他强调，标准化、经过验证的细胞处理方法对于确保同种异体细胞疗法的一致性和有效性至关重要。
最后，Tyagi 指出，起始材料的质量和成分/差异性的影响可能会因细胞类型、基因修饰的需要以及细胞疗法的最终应用而异。“某些细胞类型可能对起始材料的质量更敏感或更容易出现变异。同样，基因修饰的需要可能会带来额外的复杂性和潜在的可变性，”他解释道。
最后，Tyagi 表示，细胞疗法的最终应用也会影响起始材料的质量和成分/可变性的重要性。例如，针对危及生命的病症的疗法可能对起始材料的质量和一致性有更严格的要求。
使用多种策略来确保扩增的细胞群具有适当水平的同质性。Tyagi 表示，考虑到用作细胞治疗起始材料的供体细胞的差异性，细胞分选被广泛使用，因为它是从异质群体中分离特定细胞类型的基本技术。“通过依赖特定的细胞表面标记，这些技术，例如荧光激活和磁激活细胞分选（分别是 FACS 和 MACS），可以识别和分离所需的细胞群，确保产生针对下游应用的同质细胞群，”他说。
基因修饰是另一种使细胞工程能够表达特定标记或蛋白质的方法。Tyagi 观察到，这项技术有助于目标细胞类型的识别和分离，增强细胞群的同质性。他补充说，基因修饰还可以改善特定应用的细胞功能和特性，进一步优化它们对所需治疗或研究目的的适用性。
生产方法也会影响扩增细胞群的同质性。Tyagi 表示，培养基的成分、贴壁工艺中细胞附着基质的选择以及细胞培养过程中的物理过程参数（例如温度和溶氧含量）可以影响细胞行为和分化。他认为：“通过仔细控制这些因素，研究人员可以创造一个促进所需细胞类型生长和分化的最佳环境，这有助于维持细胞群的同质性并确保结果的一致性和可重复性。”
与此同时，微流体装置的使用提供了一种精确控制细胞分离和培养条件的方法，Tyagi 评论道。例如，它们可以根据大小和变形性等物理特性分离特定的细胞类型。“通过在微型环境中培养细胞，这些设备可以严格控制培养条件，增强细胞群的同质性，”他说。
还值得注意的是，使用不同的技术组合来确保特定类型细胞扩增后的同质性。Tyagi 表示，对于间充质干细胞 (MSC)，培养条件在维持干细胞性和防止分化方面发挥着重要作用。对于 T 细胞来说，基因修饰与细胞分选技术相结合一直是关键策略，特别是对于嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法。细胞分选对于分离造血干细胞 (HSC) 也至关重要。对于树突状细胞，通常采用培养条件操作和基因修饰的组合，而对于自然杀伤细胞，所有三种方法（细胞分选、培养条件控制、基因修饰）都有助于更均匀地扩增细胞群。
扩增的细胞群不仅必须是同质的，而且必须具有高比例的具有所需功能的活细胞。许多不同的因素都会影响扩张期间维持这些属性的能力。Tyagi 说，首先是细胞来源和类型。例如，与 T 细胞或 MSC 等体细胞相比，多能干细胞 (PSC) 需要一套不同的培养条件。“PSC 需要具有特定生长因子的滋养层或无滋养层条件，而 T 细胞和 MSC 可以使用添加有血清或无血清条件的培养基进行扩增，”他解释道。
Nanda 表示，对于转基因细胞来说，优化遗传物质的递送机制（例如病毒载体、电转等）至关重要，因为这些方法会影响细胞的活性和功能。她以 CAR T 细胞疗法的生产为例，其中涉及 T 细胞激活、基因修饰以表达 CAR，然后扩增 CAR-T 细胞。
毫不奇怪，扩增系统的选择也会影响细胞的完整性和功能。Nanda 指出，传统的平面系统在可放大性方面存在局限性，因此悬浮培养系统和生物反应器正被探索用于大规模生产。她补充说，这些系统还可以更好地控制培养条件。
与任何药物生产过程一样，整个细胞扩增过程中的质量控制 (QC) 是必须的。Nanda 说：“质量控制措施，包括监测细胞身份、纯度、效力和安全性，对于确保用于细胞疗法的细胞保持其所需的特性至关重要。” 流式细胞术、下一代测序和功能测定等先进技术用于这些目的。
最后，自动化的使用有助于减少可变性并提高再现性，而封闭系统则可最大限度地降低污染风险。扩增后，必须建立并仔细管理适当的冷冻保存和解冻过程，以维持细胞活性和功能。
在扩增过程中，某些细胞的表型可能会发生变化。对于细胞疗法来说，扩增群体中的所有细胞都必须具有所需的表型，这一点至关重要。因此，有必要采取措施避免分化。Tyagi 表示，有多种策略可以实现这一目标，具体策略取决于细胞类型、基因修饰的需要以及细胞的最终应用。
Tyagi 说，使用细胞特异性培养基、生长因子和细胞因子优化培养条件有助于在较长的扩增期内维持所需的细胞表型。例如，使用生物反应器可以更好地控制工艺参数，例如氧气水平、pH 值和营养供应，这些参数可以影响细胞分化。与此同时，缺氧条件可以激活某些信号通路，促进干性并抑制分化。还可以对细胞进行基因修饰，以改变控制细胞分化的特定基因，从而提高所需表型的稳定性。干细胞与其它类型的细胞共培养有助于维持其干性，而 3D 培养系统为细胞提供了更像体内的环境，包括有利的细胞-细胞和细胞-基质相互作用。
在较长的细胞扩增过程中保持无菌条件提出了挑战，但正在采用几种策略来解决这些问题。Nanda 表示，最重要的是使用自动化和封闭系统，并采取严格的质量控制措施。操作员培训、设施设计和一次性生产系统的使用也很重要。
Nanda 说，自动化系统可以实时控制和监测培养条件，从而可以调整温度、pH 值和营养供应等参数，以确保细胞的最佳生长条件。它们还减少了人工处理，最大限度地降低了污染风险。封闭系统还通过将细胞培养物与外部环境隔离来减少污染的可能性，严格的质量控制措施（包括定期检测）也是如此。适当的质量控制措施还确保监测和控制相关工艺参数、定期检查设备和材料，以及在细胞扩增过程的各个阶段进行彻底的质量控制和放行检测。
目前用于细胞治疗扩增的生产技术总体上非常先进，但 Tyagi 表示，许多领域的改进将是有益的。有许多不同的生物反应器可供选择，包括搅拌罐、摇摆式、中空纤维和固定床系统，每种都有其各自的优点和缺点。因此，Tyagi 指出生物反应器的选择可以显著影响所产生细胞的质量和数量。他补充说，供应商正在努力改进生物反应器设计，以释放细胞治疗应用的全部潜力。Tyagi 指出，固定床生物反应器是一种很有前景的技术，可以提高贴壁细胞疗法的产量，但由于它们是完全封闭的，因此直接观察和监测是一项挑战。
扩增后细胞收获和与生长培养基的分离通常使用离心或过滤方法来实现。目前细胞收获和分离技术相当先进，但 Tyagi 强调在此过程中维持细胞活性和产量相关的挑战。例如，虽然通常使用密度梯度离心等温和且优化的分离技术根据细胞的大小和密度将细胞从生长培养基中分离出来，但通常必须针对特定的情况优化转子速度、分离介质和流速等工艺参数。此外，Tyagi 表示，虽然该过程适用于大体积的细胞培养，但高剪切力会损坏细胞，而且该过程可能很漫长并且需要大量能量输入。
Tyagi 表示，细胞处理（洗涤、浓缩和重悬）和配制（添加添加剂或赋形剂）的设备相当先进，但这些过程也给维持细胞活性和功能带来了挑战。例如，基于封闭和自动化细胞洗涤和离心的技术可以有效地处理大量细胞，同时保持其完整性，但可能价格昂贵，需要熟练的操作人员，不适合所有细胞类型或超大规模操作，并且只有少数供应商提供此类专用设备。
Nanda 表示，在同种异体细胞疗法扩增过程的质量控制方面，需要更快速、更全面的检测方法。她指出，传统的显微镜和细胞计数可能非常耗时，并且可能无法捕获有关细胞的所有相关信息，而实时监控系统（例如在线传感器或成像技术）可以为工艺优化和产品表征提供有价值的数据，但需要考虑的因素包括高成本以及技术复杂性。
最后，用于细胞治疗生产的自动化和封闭系统的集成和验证可能具有挑战性。此外，虽然自动化细胞培养系统可以控制细胞培养过程的各个方面，从细胞接种到收获和处理它们，但 Nanda 评论说，它们的实施和维护成本可能很高，并且可能需要根据特定细胞进行大量定制工作。