是一种非常快速、高效、准确的核酸定量分析方法，是分子生物学中大多数领域的首选使用方法。按应用类型来分，qPCR可分为绝对定量和相对定量以及定性分析。但不管绝对定量还是相对定量，
理想情况下，目标序列的分子数量应在每个扩增循环中翻倍，对应于100% 的扩增效率。同样，如果扩增分子的数量少于两倍，这是由于扩增效率低下 - 低于 100%导致。扩增效率较低的最常见原因是不好的引物设计和非最佳试剂浓度或反应条件。另外，二级结构的存在，如二聚体和发夹结构或不适当的退火温度 (Tm) 会影响引物-模板退火，从而导致扩增不良。在确定扩增效率实验时，通常我们会对模板进行系列梯度稀释来做，但在系列梯度稀释过程中，每一次额星空体育登录入口 星空体育在线官网外的稀释，稀释液的DNA量可能会比预期的量更低，因此连续稀释样品的Ct值之间会出现差异(见下文)。
已知稀释步骤的 Ct 值之间的差异高于预期。10 倍稀释应该相隔 3.3 个循环，但在这种情况下，它们相距更远。
对于扩增效率的计算，我们通过对目标模板进行连续稀释然后进行qPCR扩增获取它们的 Ct 值，然后将Ct值与相应的浓度的对数值绘制曲线。接下来，通过数据点生成线性回归曲线并计算趋势线的斜率。最后，使用以下公式计算扩增效率：E = -1+10 (-1/slope)。我们在计算扩增效率时一定要了解影响扩增曲线斜率的因素，否则它可能会产生误导。
通常，理想的扩增效率星空体育登录入口 星空体育在线官网范围在90%到110%之间。理论最大值为100%，表明聚合酶处于最大工作效率。那么，扩增效率怎么可能超过100%呢？这意味着在每个qPCR循环中会产生两个以上的序列拷贝，对吗？
其主要原因是聚合酶抑制。即使将更多模板添加反应体系中，Ct 值也可能不会变得更小。这使扩增效率曲线变平，导致斜率更低，扩增效率超过100%。
聚合酶的抑制剂包括样品中过量的 DNA/RNA或 残留物质。常见的污染物包括肝素、血红蛋白、多糖、叶绿素、蛋白酶 K、乙酸钠等）。也可能是DNA/RNA提取过程中带入的各种其他物质，如乙醇、苯酚和 SDS。
如果高浓度的样品中存在抑制剂，与没有抑制剂的样品相比，需要更多的扩增循环数才能达到检测阈值。在浓度越高的样品中，抑制作用更容易发生，改善曲线斜率的方法之一是稀释样品。同时也是测试是否存在抑制问题的好方法。
让我们看一个简单的例子。在10倍稀释的样品中，在 100% 的扩增效率下，两个相邻的稀释样品的之间的 ΔCt 应该在3.3 左右。然而，如果存在抑制剂，两个样品稀释液之间的 ΔCt 可能会降低到2.8。在抑制较少的高稀释倍数样本点，该值可能会回升至接近3.3。这是由于抑制剂与 DNA/RNA一起稀释，稀释程度越高，浓度越低，就越没有抑制作用，扩增再次以最高效率运行，Ct值回归正常表现。
因此，高浓度样品和稀释样品之间的 ΔCt 值比预期的要小，导致扩增效率高于 100%。
即使反应体系中存在更多模板，由于抑制作用，Ct值也可能不会发生相应的偏移，从而使扩增效率图变得平坦，斜率较低，扩增效率超过100%。
这种情况通常可以通过使用高度稀释的样品来避免。如果发生抑制，在计算扩增效率时应将高浓度样品 排除在分析之外 。同样，由于随机效应，在变异性高的情况下，大多数稀释样本也应省略。因此，在定量研究中，超高浓度或过低稀释的样品是不合适的（见下文）。
在 qPCR 实验之前，可使用分光光度法分析 DNA/RNA 样品的纯度，可以很容易的避免扩增抑制的发生。以 260 和 280 nm 处的吸光度值之比（与核酸与其他分子之比相对应）作为纯度评估。纯的DNA比值为1.8 ， RNA为 2.0，若纯度不够则应对样品进行纯化。同样，您也可以使用不同的样品制备方法。如果额外的纯化步骤不能解决问题，则样品可能本身就难以处理。在这种情况下，可以考虑使用更耐受抑制剂的 qPCR mix（推荐FS-Q1002，可耐受各种抑制剂）。
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