技术领域 [0001] 本发明涉及可以高纯度及高扩增倍率来扩增具有高溶细胞活性（細胞傷害活性） 的自然杀伤细胞（NK 细胞）的方法、和包含通过该方法而得到的 NK 细胞的医药组合物。
背景技术 [0002] NK 细胞并不攻击表达 MHC 类 I 型分子的正常细胞，而主要攻击 MHC 类 I 型分子的表 达降低及缺损的细胞。因此，如果在癌症及传染病的细胞疗法使用该种 NK 细胞，则具有可 以回避 GVH（Graft-versus-host，移植物抗宿主）病的副作用的优点。实际上，根据 Miller 等人（非专利文献 1）及 Rubnitz 等人（非专利文献 2）的报告，在将癌症患者作为受体、并在 将 NK 细胞浓缩了的基础上移植其近亲的健康者供体的新鲜外周血单核细胞时，被移植的 NK 细胞不会对受体引起副作用，而暂时地存活，并保持溶细胞活性。但是，尚未有显示出 NK 细胞的移植疗法有效性的临床治疗试验的报告。其理由之一在于，可从供体通过淋巴球血 液成分单采而回收的细胞数量是有限的，因而在直到目标细胞灭绝为止的期间，无法使为 使癌细胞及病原体感染细胞这样的目标细胞灭绝所需要的足够数量的 NK 细胞滞留在受体 体内。 [0003] 由正常成人的外周血的 1 次血液成分单采可回收约 1×1010 个的单核细胞，如果 将外周血单核细胞中的 NK 细胞的构成比率设为约 7%，则可以得到 7×108 个 NK 细胞（非专 利文献 3）。另一方面，NK 细胞的移植中，使用 1×105 个 /kg 至 2×107 个 /kg（非专利文献 1）、或者 5×105 个 /kg 至 8.1×107 个 /kg（非专利文献 2）的数量级的 NK 细胞。如果将患 者的体重设为 60kg，则将需要 6×106 个至 4.8×109 个的 NK 细胞。这相当于由正常成人的 外周血的 1 次血液成分单采而得到的 NK 细胞的 0.0086 倍至 6.86 倍。但是，例如根据非专 利文献 2，并未发现 NK 细胞的存活时间与给予的 NK 细胞的数量相关，在 2 天至 189 天内，存 活时间的中间值仅为 10 天。由此，在直到目标细胞灭绝为止的期间，为了使为使癌细胞及 病原体感染细胞这样的目标细胞灭绝所需要的足够数量的 NK 细胞滞留在受体体内，需要 频繁地重复 NK 细胞的移植，这对患者而言将成为极大的负担。 [0004] 因此，正在推进使由供体得到的 NK 细胞先在试管内培养扩增，来得到为使目标细 胞灭绝所需要的足够的 NK 细胞的技术的开发。Terunuma,H. 等人（专利文献 1）在对人 CD3 的激动剂抗体即 OKT3、IL-2、抗 CD16 抗体的存在下，将健康者的外周血单核细胞培养 13 天， 使 NK 细胞扩增至纯度 81.2%、130 倍。此外，所述 NK 细胞对星空体育网站 星空体育首页 K562 细胞的溶细胞活性（E ：T=3 ： 1）为 66%。Tanaka,J. 等人（专利文献 2）通过使用添加了 IL-2、IL-15、抗 CD3 抗体、5% 的 人 AB 型血清、他克莫司（tacrolimus）及达肝素钠（dalteparin）的培养基的方法，将健康者 的外周血单核细胞培养 21 天，使 NK 细胞扩增至纯度 73.4%、6268 倍。此外，所述 NK 细胞对 K562 细胞的溶细胞活性（E ：T=1 ：1）约为 55%。Carlens,S. 等人（非专利文献 4）报告了 ：在 对人 CD3 的激动剂抗体即 OKT3、IL-2 的存在下，将健康者的外周血单核细胞培养 21 天，使 NK 细胞扩增至纯度 55%、193 倍。此外，所述 NK 细胞对 K562 细胞的溶细胞活性（E ：T=1 ：1） 为 45%。Alici,E. 等人（非专利文献 5）报告了 ：在同样的条件下将骨髓瘤患者的外周血单
使 NK 细胞扩增来制备细胞疗法的最佳数量的 NK 细胞的技术。本发明提供一种 NK 细胞的扩增方 法。本发明的 NK 细胞的扩增方法包括 ：制备包含 NK 细胞的细胞群的步骤 ；从所述包含 NK 细胞的细 胞群中将 T 细胞除去的步骤 ；和在包含 2500IU/mL 至 2813IU/mL 的 IL-2 的培养基中培养除去了所述 T 细胞后的剩余的细胞的步骤。有时本发明的 NK 细胞的扩增方法包括，从所述包含 NK 细胞的细胞 群中将造血前体细胞除去的步骤。本发明提供一 种用于细胞疗法的医药组合物，其包含通过本发 明的 NK 细胞的扩增方法而制备的 NK 细胞。有时 本发明的用于细胞疗法的医药组合物用于治疗传 染病和 / 或癌症。
(71)申请人 国立大学法人九州大学 地址 日本国福冈县 申请人 泰来株式会社
(72)发明人 米满吉和 原田结 齐藤智 矢崎雄一郎 冈本正人 石田尾武文
1. 一种 NK 细胞的扩增方法，其特征在于，包括 ： 制备包含 NK 细胞的细胞群的步骤 ； 从所述包含 NK 细胞的细胞群中将 T 细胞除去的步骤 ；和 在包含 2500IU/mL 至 2813IU/mL 的 IL-2 的培养基中培养除去了所述 T 细胞后的剩余 的细胞的步骤。 2. 根据权利要求 1 所述的 NK 细胞的扩增方法，其特征在于，从所述包含 NK 细胞的细胞 群中将所述 T 细胞除去的步骤是通过将 CD3 阳性细胞除去的步骤来实现的。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的 NK 细胞的扩增方法，其特征在于，包括从所述包含 NK 细 胞的细胞群中将造血前体细胞除去的步骤。 4. 根据权利要求 3 所述的 NK 细胞的扩增方法，其特征在于，从所述包含 NK 细胞的细胞 群中将所述造血前体细胞除去的步骤是通过将 CD34 阳性细胞除去的步骤来实现的。 5. 根据权利要求 1 至 4 中任一项所述的 NK 细胞的扩增方法，其特征在于，所述培养基 包含自体血清、AB 型血清和 / 或血清白蛋白。 6. 根据权利要求 1 至 5 中任一项所述的 NK 细胞的扩增方法，其特征在于，制备所述包 含 NK 细胞的细胞群的步骤是通过从采集自受试者的血细胞中将单核细胞分离的步骤来实 现的。 7. 根据权利要求 6 所述的 NK 细胞的扩增方法，其特征在于，所述血细胞采集自外周血、 脐带血、骨髓和 / 或淋巴结。 8. 根据权利要求 7 所述的 NK 细胞的扩增方法，其特征在于，通过血液成分单采术从外 周血采集所述血细胞。 9. 根据权利要求 1 至 5 中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含 NK 细胞的细胞群 由选自源于干细胞的造血干细胞、源于脐带血的造血干细胞、源于外周血的造血干细胞、源 于骨髓血的造血干细胞、脐带血单核细胞、和外周血单核细胞中的至星空体育网站 星空体育首页少 1 种细胞来制备，其 中所述干细胞为选自胚胎干细胞、成体干细胞及人工多能干（iPS）细胞中的任意一种。 10. 一种用于细胞疗法的医药组合物，其特征在于，包含通过权利要求 1 至 9 中任一项 所述的扩增方法而制备的 NK 细胞。 11. 根据权利要求 10 所述的医药组合物，其特征在于，用于治疗传染病和 / 或癌症。