急性酒精中毒是一种以行为和神经症状为特征的有害临床疾病，目前尚无有效的治疗方法。据报道，小胶质细胞BV-2细胞的功能障碍与急性酒精诱导的脑损伤有关。本研究探讨了杜仲叶多糖（EULP）对急性酒精性脑损伤和小胶质细胞功能障碍的保护作用。14天的EULP预处理显著减轻了急性酒精暴露引起的小鼠脑组织神经行为缺陷和神经递质损伤。此外，代谢组学分析揭示EULP调节脑组织的代谢紊乱。研究结果表明，EULP预处理显著改善了酒精诱导的BV-2细胞吞噬功能的降低、氧化应激和炎症。因此，EULP未来可用作酒精诱导脑损伤的潜在治疗剂。
小鼠的脑指数可以部分反映脑损伤的程度。如图1B所示，与正常（NC）组相比，急性饮酒导致大脑重量指数显著增加。与酒精模型（AM）组相比，低剂量（MEL）组的大脑指数显著降低。我们通过组织切片直观地观察了急性酒精暴露后小鼠脑组织的损伤程度以及EULP对其损失程度的影响。如图1A所示，NC组海马锥体细胞数量众多，连接紧密，浅核染色面积较大。与NC组相比，AM组海马中的锥体细胞减少、浓缩、染色加深、排列松散。与AM组相比，为期14天的三剂EULP预处理对酒精诱导的脑组织损伤表现出不同程度的降低作用。具体而言，MEL组海马锥体细胞的病变在一定程度上减轻，但细胞仍表现出固缩和深度染色。高剂量（MEH）组海马神经细胞明显固缩，神经细胞部分溶解。此外，与AM组相比，高剂量短期EULP处理（SE）组的海马锥体细胞病变减少，细胞固缩和深染色显著改善。
图1 EULP对急性酒精诱导的病理变化和神经递质紊乱的影响。（A）组织病理学变化采用HE染色（200×）进行评估。（B）小鼠脑重量指数。观察各组小鼠脑组织中乙酰胆碱(AchE)（C）、多巴胺(DA)（D）、内啡肽(β-EP)（E）和氨基丁酸(GABA)（F）的含量。所有数值均为平均值±S.D.（n=8）。没有共同字母的标记字符与其他组相比有显著差异（p0.05）。
由于神经递质在认知和记忆功能中起着重要作用，我们分析了EULP对大脑功能相关神经递质的潜在影响。如图1（C–F）所示，酒精诱导AChE活性显著下调，DA、GABA和β-EP活性上调。与AM组相比，补充EULP在一定程度上恢复了神经递质水平，短期EULP处理（SE）组没有检测到显著变化。
图2 EULP对急性酒精诱导的神经炎症和氧化障碍的影响。各组小鼠脑组织中谷胱甘肽(GSH)（A）和超氧化物歧化酶(SOD)（B）的定量。还检测了脑组织中NO（C）、TNF-α（D）、IL-6（E）和IL-10（F）的水平。所有数值均为平均值±S.D.（n=8）。没有共同字母的标记字符与其他组相比有显著差异（p0.05）。
越来越多的证据表明，神经炎症和氧化应激与各种大脑异常有关。在此，我们研究了EULP对大脑中细胞因子和氧化剂表达的影响。如图2所示，与正常小鼠相比，我们在酒精处理的小鼠大脑中观察到TNF-α和IL-6水平显著升高，IL-10水平以及GSH和SOD活性显著降低。14天的EULP预处理显著降低了急性酒精小鼠大脑中TNF-α和IL-6的浓度，并增加了IL-10、GSH和SOD的含量。此外，与AM组相比，除SE组外，所有EULP给药组的一氧化氮（NO）含量都明显较高，这是一种中性疏水性信号分子，其作用主要发生在组织内部。
图3 EULP对酒精诱导的脑组织代谢紊乱的影响。（A）小鼠脑组织中差异代谢产物与脑损伤标志物的相关性分析。（D）小鼠脑组织中不同脂质代谢产物与脑损伤标志物的相关性分析。两组间差异有统计学意义（P0.01）。（B）NC组和AM组代谢途径图。每个数字表示：1：甘油磷脂代谢；2：苯丙氨酸代谢；3：色氨酸代谢；4:丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；5：氨基酸糖和核苷酸糖代谢；6：糖酵解/葡萄糖新生；7：戊糖和葡萄糖醛酸相互转化；8：嘌呤代谢；9：丙酮酸代谢；10:柠檬酸循环（TCA循环）。（C）NC组和AM组代谢途径图。每个数字表示：1：甘油磷脂代谢；2：鞘脂代谢；3：丙酮酸代谢；4:赖氨酸降解；5：色氨酸代谢；6:精氨酸和脯氨酸代谢；7：氨基糖和核苷酸糖代谢。（E）NC组和AM组的脂质代谢通路图。每个数字代表：1：视黄醇代谢；2：鞘脂代谢；3：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；4:苯丙氨酸代谢；5：甘油磷脂代谢。（F）AM组和高剂量组的脂质代谢通路图。每个数字代表：1：甘油磷脂代谢；2：鞘脂代谢。
经过非参数t检验（p1）分析，我们筛选出6种与脑损伤相关的差异代谢产物。Pearson分析用于进一步分析差异代谢产物与大脑中神经递质、炎症因子之间的相关性。如图3（A）所示，GABA、DA和EP以及IL-6和TNF-α与次黄嘌呤和S-乙酰基二氢硫酰胺-E呈正相关，而与PE、PC和PS呈负相关。AChE与苯甲酸呈正相关，与次黄嘌呤和S-乙酰基二氢硫酰胺-E呈负相关。此外，IL-10与PE、PC和PS呈正相关，与次黄嘌呤和S-乙酰基二氢硫酰胺-E呈负相关。
我们使用MetaboAnalyst 4.0网站上的通路分析对数据进行分析，并创建代谢产物通路图，通路影响0.1，−log10（p）0.05通常被选为显著。如图3（B–C）所示，与NC组相比，酒精摄入显著改变了小鼠脑组织中甘油磷脂代谢、苯丙氨酸代谢和色氨酸代谢的三种代谢途径。EULP预处理显著改善了甘油磷脂代谢和色氨酸代谢信号通路，鞘脂代谢、丙酮酸代谢和赖氨酸降解三条信号通路也得到了一定程度的改善。
图4 EULP对酒精诱导的小胶质细胞BV-2氧化应激的影响。（A）每组细胞中细胞内ROS含量的代表性流式细胞图（A）和定量数据（B）。（C）各组细胞中MDA水平的定量。所有数值均为平均值±S.D.（n=3）。与EtOH模型组相比，*p0.05、**p0.01；与对照组比较，#p0.05、##p0.01。
如图3（E-F）所示，与正常小鼠相比，酒精摄入导致小鼠脑组织中五种脂质代谢途径发生显著变化，包括视黄醇代谢、鞘脂代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢和甘油磷脂代谢。然而，与AM组相比，EULP预处理显著影响了甘油磷脂代谢和鞘脂代谢信号通路。
我们通过检测细胞内ROS和MDA水平来评估EULP在减少EtOH诱导的BV-2细胞氧化应激中的作用。如图4所示，与对照组相比，用高酒精（10 mg/mL）处理3小时显著增加了BV-2细胞中ROS的产生，同时显著升高了MDA水平，这与我们之前的研究一致。在用酒精刺激前，用不同浓度的EULP（5、10和20μg/mL）预处理BV-2细胞12小时，显著降低了EtOH诱导的细胞内ROS和MDA。
6. EULP减少EtOH诱导的小胶质细胞BV-2细胞中NO和炎症因子的释放
根据图5（A），与对照组相比，用高酒精（10 mg/mL）处理3小时显著诱导NO浓度，而所有剂量的EULP预处理显著阻止了BV-2细胞中NO的释放。此外，我们使用ELISA测定法定量释放到细胞培养基中的促炎细胞因子IL-1β的水平。与对照组相比，酒精显著增加了IL-1β的细胞释放。在治疗剂量范围内，EULP预处理极大地抑制了炎症因子的释放。
流式细胞术分析的细胞质钙水平表明，高剂量的酒精（10 mg/mL）诱导细胞钙超载（导致细胞凋亡），这与我们之前的研究一致。与模型组相比，三种不同剂量的EULP预处理均显著提高了BV-2细胞中的Ca2+水平，如图6所示。
图7显示了检测BV-2细胞吞噬作用的代表性流式细胞术图，图中P3表示10000个BV-2细胞吞噬一个荧光乳胶微球的比例，P4表示10000个BV-2细胞吞噬两个荧光乳胶球的比例，依此类推。与我们之前的研究一致，与对照组相比，在暴露于高酒精浓度（10 mg/mL）3小时后，吞噬五个乳胶微球（P7）的细胞内荧光强度显著降低。与模型组相比，EULP预处理显著提高了吞噬五个乳胶微球的细胞的细胞内荧光强度，且呈浓度依赖性，表明EULP可增强BV-2细胞的吞噬作用。
图7 EULP对酒精诱导的小胶质细胞BV-2吞噬功能下降的影响。（A）使用黄绿色乳胶微球和流式细胞术检测细胞摄取乳胶微球的代表性流式细胞图。（B）定量数据。所有数值均为平均值±S.D.（n=3）。与EtOH模型组相比，*p0.05、**p0.01；与对照组比较，#p0.05、##p0.01。
研究者们对过度饮酒与人类健康之间关系的观察已经持续了很长一段时间。一些醉酒症状通常发生在饮酒后不久，并持续数小时甚至24小时，这取决于性别、体重和遗传因素。酒精对大脑功能有许多直接影响，从而影响人类行为，包括情绪失控、身体失衡、头痛，甚至部分大脑记忆丧失，如昏厥。根据之前的研究，酒精可以通过影响小胶质细胞等免疫细胞直接伤害大脑，引发氧化应激和炎症，从而导致神经元细胞死亡。动物模型是了解酒精中毒及其相关疾病发病机制的重要工具。通过单次过量饮酒模拟的急性酒精中毒已被发现可显著增强神经元坏死并激活小胶质细胞，最终导致脑损伤。在本研究中，在给予含56%酒精的15mL/kg•BW红星二锅头酒后，大脑指数显著增加，表明大脑肿胀肥大，这与组织病理学结果一致，即与健康小鼠相比，海马中的锥体细胞减少且排列松散；我们在酒精小鼠的大脑中也观察到神经递质的紊乱，神经递质在中枢神经系统（CNS）内的突触传递过程中起信使的作用，影响了作为大脑功能结构基础的神经回路。结果表明，14天的EULP预处理在一定程度上降低了脑重量并恢复了神经递质水平，在短期EULP处理（SE）组中没有检测到显著变化。
对于大脑相关疾病，应考虑神经炎症和氧化应激。中枢神经系统中免疫细胞的炎症反应被称为神经炎症，当身体的还原和氧化反应（氧化还原）星空体育登录入口 星空体育在线官网不平衡时，它会伤害大脑。与正常小鼠相比，用酒精处理的小鼠大脑显示出显著更高水平的TNF-α和IL-6，更低水平的IL-10，以及降低的GSH和SOD活性，这与之前的研究一致。相应地，通过TNF-α和IL-6的浓度降低，IL-10、GSH和SOD的含量增加；急性酒精小鼠大脑中H&E染色研究的结果，证实了长期EULP预处理对神经炎症的缓解和抗氧化剂的增强。
我们进一步基于UPLC-Q-TOF/MS对各组小鼠的脑组织进行代谢分析。我们分析了脑组织的整体代谢，发现急性酒精诱导的代谢异常主要与脂质代谢有关，如甘油磷脂代谢、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢和鞘脂代谢，脂质代谢分析进一步证实了这一点。在预防EULP后，甘油磷脂代谢、色氨酸代谢和鞘脂代谢信号通路得到了显著改善。研究表明，甘油磷脂代谢紊乱会影响神经元的结构和功能，最终导致小鼠神经行为异常。Wu等人证明，红茶多糖可以改变某些基因的定量表达，从而影响脂肪代谢途径，改变甘油磷脂代谢，抑制脂肪的形成和积累，促进其分解，从而预防肥胖。此外，已经发现甘油磷脂代谢与各种抑郁样行为密切相关，支持微生物肠脑轴的破坏，可能是抑郁发作的媒介。鞘磷脂在质膜中起着至关重要的作用，是大脑健康生长和功能所必需的。Hong等人发现，白牡丹多糖可能通过鞘脂代谢来保护大鼠免受环磷酰胺诱导的肝损伤。与先前的研究一致，EULP可能通过调节甘油磷脂代谢和鞘脂代谢来影响酒精诱导的脑损伤。
小胶质细胞之所以成为一个潜在靶点，不仅是因为它们在大脑发育和稳态中的作用，还因为它们在对酒精滥用的反应中的双重作用，酒精滥用可能是致病性的，导致神经炎症和组织损伤，或修复/解决炎症和损伤。我们之前的研究发现，过量饮酒会导致不同程度的细胞器损伤和氧化应激，最终影响BV-2细胞的自噬-吞噬轴功能，最终导致细胞凋亡。高剂量的酒精处理后小胶质细胞BV-2细胞中一致出现氧化应激升高，然而，EULP预处理显著降低了ROS和MDA水平。酒精处理后，BV-2细胞中NO和IL-1β的表达显著增加，这可能导致大脑炎症，而大脑炎症在饮酒诱导的神经毒性中起着核心作用。然而，与酒精处理组相比，EULP预处理成功抑制了NO和IL-1β的表达。
作为大脑中的单核巨噬细胞，吞噬作用是BV-2细胞的一项重要功能。与其他研究一致，与正常星空体育登录入口 星空体育在线官网细胞相比，过量酒精处理显著降低了BV-2细胞的吞噬作用。然而，EULP预处理可以显著增强这种功能，正如我们的发现所证明的那样，用EULP预处理的BV-2细胞中突触的数量和长度与模型组相比是更好的。BV-2细胞中Ca2+活性的程度直接影响细胞的过程动力，BV-2细胞的扩增和生长都伴随着突起中局部Ca2+信号的增加。可以注意到，EULP预处理显著进一步提高了暴露于酒精的BV-2细胞中Ca2+含量，并促进了突触延伸，这与巨噬细胞的吞噬能力呈正相关。这些发现表明，EULP通过促进突触形成显著改善了用酒精预处理的BV-2细胞的吞噬作用，这也是EULP保护BV-2细胞免受酒精影响的方式之一。
这项研究的关键发现表明，EULP预处理对急性酒精诱导小鼠脑损伤的神经保护作用被认为是通过缓解神经递质紊乱、神经炎症和氧化障碍发挥作用的。根据大脑的代谢研究，EULP可能调节脑组织的代谢紊乱，主要是脂质代谢，如甘油磷脂代谢和鞘脂代谢。EULP还通过上调吞噬作用、抑制氧化应激和炎症来发挥显著的小胶质细胞保护作用。基于这些发现，可以得出结论，杜仲叶多糖是一种很有前景的治疗急性酒精性脑损伤的药物，但还需要进一步的临床试验。
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