免疫细胞培养的六个基本流程：样本制备、细胞分选、分型鉴定、扩增&培养、质量优化、后续研究。小优已经给大家详细介绍了《免疫细胞培养通关技巧之样本制备》和《免疫细胞培养通关技巧之细胞分选》，《免疫细胞培养通关技巧之分型鉴定》今天我们继续一起学习扩增&培养的相关知识。
扩增&培养（Amplification and Culture）：从样本制备到细胞分选、分型鉴定，我们终于获得了纯度高、活性好的目的细胞之后，便需要在体外人工模拟其在体内的生长环境，同时保证无菌、适宜的温度和pH，给予免疫细胞充足的营养使其不断生长繁殖，这个过程便是扩增&培养，主要可分为培养体系建立、传代流程、冻存和复苏。
不同免疫细胞涉及的细胞因子、激活信号大不相同，因此培养体系也不可同一而论；同一免疫细胞不同来源（如PBMC来源、脐带血来源、iPSCs或ESCs）的具体培养方案也存在差别。小优列举了一些免疫细胞的培养体系以作参考，大家可以针对自己的实验需求进行摸索和优化，以获得扩增效率高、细胞纯度高、活性好的最佳培养方案。
T细胞的激活涉及到两个信号：TCR/CD3与APC表面特异的MHC-多肽复合物结合产生的特异性抗原刺激信号；APC表面多对共刺激分子和T细胞相应受体作用后产生的非特异性的共刺激信号。最常见的用于T细星空体育登录入口 星空体育在线官网胞体外活化的是Anti-CD3和Anti-CD28，在两者的协同作用下，可使T细胞充分活化[1]。此外，我们还需添加不同的细胞因子以诱导T细胞向不同的方向分化（图1）。
1.将含有1%青霉素-链霉素及5%血清的X-VIVO15培养基恢复至室温，重悬分离后的T细胞，加入anti-human CD3/CD28磁珠（与细胞数量1:1），促进T细胞活化和增殖；
以上是一篇文献的T细胞分化方案，小优也汇总了体外诱导T细胞分化的一些细胞因子（图2），可供大家参考。
Tips：原代T细胞一般在体外的培养时间不超过三周，用于功能实验的T细胞建议培养时间在14天以内。
当然，PBMC（human）来源的NK细胞体外扩增的方法有很多：细胞因子−抗体融合、饲养细胞或膜颗粒。小优也找到一篇24.1分的综述，详细列举了不同扩增方案的培养基、添加物、培养天数、扩增效率、细胞纯度，大家可以按需保存！
1.将含有1%青霉素-链霉素及2%人血清的X-VIVO 15培养基恢复至室温，使用上述培养基将分离的单核细胞重悬，细胞密度为1x106cells/mL，放入37°C、5%CO2的培养箱中，等待1小时左右使细胞贴壁；
2.单核细胞经培养后即开始分化为广义M0巨噬细胞。接种后第三天，更换新鲜培养基并加入25 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），以促进M1表型，或50ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），以促进M2表型。第六天，可再次更换新鲜培养基并加入100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ，使细胞极化为M1-巨噬细胞表型，或加入10 ng/mL M-CSF和20 ng/mL IL-4；继续培养24h即可。
1.树突状细胞体外培养时一般星空体育登录入口 星空体育在线官网不增殖，可在培养环境中存活1周或更长时间。如果细胞需要持续培养超过一夜，建议在X-VIVO15添加500 U/mL GM-CSF和500 U/mL IL4，以确保维持DC表型。
（1）冻存：在细胞密度达到107cells/mL时可进行冻存，采用分步冷冻法。具体步骤如下：
1.悬浮细胞500 g室温离心10 min收集细胞沉淀，贴壁细胞胰酶消化并终止后离心收集；
3.将冻存管放置-20℃ 1 h；-80℃过夜；转移至液氮中进行长期保存。
Tips：复苏的免疫细胞建议通过血细胞计数计算细胞悬液中的细胞数量，并通过台盼蓝染料测定细胞活力。
免疫细胞的扩增&培养至关重要但也困难重重，最后，小优给大家推荐两个好帮手：
Lonza的X-VIVO系列无血清培养基作为明星产品，是针对细胞治疗和基因治疗领域专门开发的人免疫细胞培养基，不含任何外源性生长因子等各种刺激物质，助力细胞治疗研究！
R&D systems作为蛋白和ELISA的金标准，可提供基底膜提取物以及生长因子、小分子、培养基和培养基补充试剂。
好啦，免疫细胞培养通关技巧之扩增&培养的内容也给大家介绍完了，下一个质量优化，我们不见不散呀！