申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。
申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。
申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。
授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。
发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。
专利优先权是指专利申请人就其发明创造第一次提出专利申请后，在法定期限内，又在中国以相同主题的发明创造提出专利申请的，根据有关法律规定，其在后申请以第一次专利申请的日期作为其优先权日，专利申请人依法享有的这种权利，就是优先权。
专利优先权的目的在于，避免在优先权日与实际申请日之间公开的技术内容影响本申请的新颖性和创造性。
专利优先权是指专利申请人就其发明创造第一次提出专利申请后，在法定期限内，又在中国以相同主题的发明创造提出专利申请的，根据有关法律规定，其在后申请以第一次专利申请的日期作为其优先权日，专利申请人依法享有的这种权利，就是优先权。
专利优先权的目的在于，避免在优先权日与实际申请日之间公开的技术内容影响本申请的新颖性和创造性。
专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。
专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。
[0021] 本发明人还惊讶地发现，微量白酒草皂苷R，血浆和HSA (人血清白蛋白，HumanSerum Albumin)与DMSO结合制备免疫细胞的冻存液，可以降低DMSO的使用量，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
[0022] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫细胞冻存液，其包含0.2-0.8体积％的01^0; 2-15体积％的批六;0.001g/ml的白酒草皂苷R，20-88体积％的血浆；以及余量培养基。发明人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存免疫细胞，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，并且细胞回收率高。
[0024] 发明人惊奇地发现，利用该方法对单个核细胞进行诱导扩增培养得到大规模的免疫细胞，具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点。并且，该方法冻存的大规模的免疫细胞，有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高，从而满足临床治疗大量免疫细胞的需要。
[0025] 另外，根据本发明上述实施例的免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法还可以具有如下附加的技术特征：
[0026] 根据本发明的实施例，所述免疫细胞激活培养基和所述免疫细胞扩增培养基中，所述沙培林的浓度均为〇. 007-0.013KE/ml，优选地，为0. ΟΙΚΕ/ml。
[0027] 根据本发明的实施例，所述免疫细胞激活培养基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养基中，所述白介素-2的浓度均为700-1300IU/ml，优选地，为1000IU/ml〇
[0028] 根据本发明的实施例，所述免疫细胞激活培养基、所述免疫细胞扩增培养基和所 述免疫细胞规模化扩增培养基中，所述无血清淋巴细胞培养基均为OpTmi zer™ CTS™无血清培养基或SuperCulture TM L500人淋巴细胞无血清培养基。
[0029] 根据本发明的实施例，所述免疫细胞激活培养基中，所述第一血浆的浓度为7-13体积％，优选地，为10体积％。
[0030] 根据本发明的实施例，所述第一血浆和所述第二血浆均为自体血浆。
[0031] 根据本发明的实施例，所述免疫细胞冻存液中，所述DMSO的浓度为10体积％ ;所述HSA的浓度为5体积％ ;所述第二血浆的浓度为40体积％ ;所述冻存培养基为1640培养基或Stemspan培养基。
[0032] 根据本发明的实施例，所述冷冻复苏液中，所述白蛋白为人白蛋白，任选地，所述人白蛋白来源于市售人血清白蛋白或自体血浆。
[0033] 根据本发明的实施例，所述白蛋白的含量为1 -5 %，优选地，为2.5 %。
[0035] 根据本发明的实施例，所述右旋糖酐的含量为2-8重量％，优选地，为5重量％。
[0036] 根据本发明的实施例，所述免疫细胞为自然杀伤细胞和树突状细胞。
[0037] 根据本发明的实施例，当所述初步诱导扩增的免疫细胞的CD56的表达超过70 %时，进行所述第二诱导扩增培养。
[0038] 根据本发明的实施例，当所述分化的免疫细胞的CD56的表达超过90%时，进行所 述第三诱导扩增培养。
[0039] 根据本发明的实施例，所述第一诱导扩增培养过程中，每1天传代一次。
[0040] 根据本发明的实施例，所述第二诱导扩增培养过程中，每2天传代一次。
[0041] 根据本发明的实施例，所述第三诱导扩增培养过程中，每2天传代一次。
[0042] 根据本发明的实施例，每IO6-IO9个所述大规模的功能激活的免疫细胞采用Iml所述免疫细胞冻存液。
[0043] 根据本发明的实施例，所述冻存的免疫细胞融化后与所述冷冻复苏液混合的体积比为1:0.5-5，优选地，为1:1。
[0044] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
[0046] 本发明提出一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，该方法诱导扩增免疫细胞，诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低，并且诱导扩增获得的大规模的功能激活的免疫细胞长期保存后复苏依然保持良好的细胞特性。
[0047] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0048] 图1显示了根据本发明一个实施例的培养不同时间的外周血单个核细胞数和细胞活性的结果示意图；
[0049] 图2显示了根据本发明一个实施例的培养14天前后的外周血单个核细胞中的淋巴细胞的比例结果示意图；
[0050] 图3显示了根据本发明又一个实施例的培养不同时间的外周血单个核细胞数和细胞活性的结果示意图；
[0051] 图4显示了根据本发明一个实施例的培养12天前后的外周血单个核细胞中的淋巴细胞比例的结果示意图；
[0052] 图5显示了根据本发明一个实施例的裸鼠致瘤实验的结果示意图。
[0053] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0054] 需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0055] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:利用CD16抗体包被培养容器，得到包被后的培养容器;利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于包被后的培养容器中进行第一诱导扩增培养，得到初步诱导扩增的免疫细胞;利用免疫细胞扩增培养基将初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，得到分化的免疫细胞;利用免疫细胞规模化扩增培养基将分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，获得大规模的功能激活的免疫细胞;利用免疫细胞冻存液冻存大规模的功能激活的免疫细胞，得到冻存的免疫细胞;将冻存的免疫细胞置于37-42Γ水浴中融化，并与免疫细胞的冷冻复苏液混合，得到复苏细胞混合液；以及将复苏细胞混合液进行离心处理，得到复苏的免疫细胞。
[0056] 发明人惊奇地发现，利用该方法对单个核细胞进行诱导扩增培养得到大规模的免疫细胞，具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点。并且，该方法冻存的大规模的免疫细胞，有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高，从而满足临床治疗大量免疫细胞的需要。
[0057] 根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基;免疫细胞扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基;免疫细胞规模化扩增培养基为添加了白介素-2的无血清淋巴细胞培养基。利用该培养基组对单个核细胞进行诱导扩增培养得到大规模的免疫细胞，具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点，从而满足临床治疗大量免疫细胞的需要。
[0058] 根据本发明的实施例，免疫细胞冻存液包含：2-10体积％的01^0、2-15体积％的HSA、20-88体积％的第二血浆和余量冻存培养基。由此，该免疫细胞冻存液中添加了第二血浆，并且各组分的比例适宜，免疫细胞的有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
[0059] 其中，需要说明的是，当所述DMS0、HSA和血浆的体积百分数之和小于1时，免疫细胞冻存液进一步包含剩余体积的培养基。例如，在免疫细胞冻存液中，当DMSO的浓度为10体积％、HSA的浓度为2%体积，血浆的浓度为88%体积时，该免疫细胞冻存液不包含培养基； 当DMSO的浓度为5体积％、HSA的浓度为2%体积，血浆的浓度为88%体积时，该免疫细胞冻存液包含5 %体积的培养基；当DMSO的浓度为10体积％、HSA的浓度为5 %体积，血浆的浓度为40 %体积时，该免疫细胞冻存液包含45 %体积的培养基。
[0060] 根据本发明的实施例，冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐。由此，利用包括白蛋白和右旋糖酐的冷冻复苏液稀释融化的免疫细胞，在常温下，不仅减少在细胞冻存液中的DMSO对免疫细胞的伤害，而且冷冻复苏液中的白蛋白和右旋糖酐对融化的免疫细胞渗透压和营养起调节作用。
[0061] 根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基和所述免疫细胞扩增培养基中，沙培林的浓度均为〇. 007-0.013KE/ml。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗肿瘤和提高免疫力等临床治 疗。
[0062] 根据本发明的优选实施例，免疫细胞激活培养基和所述免疫细胞扩增培养基中，沙培林的浓度均为〇. OlKE/ml。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度更快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗肿瘤和提高免疫力等临床治疗。
[0063] 根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基、免疫细胞扩增培养基和免疫细胞规模化扩增培养基中，白介素-2的浓度均为700-1300IU/ml。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗肿瘤和提尚免疫力等临床治疗。
[0064] 根据本发明的优选实施例，免疫细胞激活培养基、免疫细胞扩增培养基和免疫细胞规模化扩增培养基中，白介素-2的浓度均为1000IU/ml。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度更快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗肿瘤和提高免疫力等临床治疗。
[0065] 根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基、免疫细胞扩增培养基和免疫细胞规模化扩增培养基中，无血清淋巴细胞培养基均为ApTmizer™ CTS™无血清培养基或SuperCulture ™ L500人淋巴细胞无血清培养基。由此，有利于免疫细胞的体外高效扩增培养，并且保持较高的功能活性。
[0066] 根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基中，第一血浆的浓度为7-13体积％。由此，有利于免疫细胞的体外高效扩增培养，并且保持较高的功能活性。
[0067] 根据本发明的优选实施例，免疫细胞激活培养基中，第一血浆的浓度为10体积％。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度和效率显著提高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能。
[0068] 根据本发明的实施例，第一血浆和第二血浆均为自体血浆。由此，免疫细胞对血浆的排异作用小，免疫细胞的诱导和增殖速度和效率显著提高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能。
[0069] 其中，需要说明的是，在本文中所使用的术语“自体血浆”是指与待诱导扩增和冻存的细胞具有同一来源的血浆。换言之，即该血浆与待诱导扩增的单个核细胞取自同一个体。由此，对自体的免疫细胞排异作用小，有利于冻存细胞的保护。
[0070] 根据本发明的实施例，免疫细胞冻存液中，DMSO的浓度为10体积％ ;HSA的浓度为5体积％ ;第二血浆的浓度为40体积％ ;冻存培养基为1640培养基或Stemspan培养基。由此， 冷冻复苏过程中渗透压调节效果好，，对细胞的保护作用突出，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，从而能够有效保护细胞，提高细胞存活率，并且合理控制冻存液的成本。根据本发明的实施例，冷冻复苏液中，白蛋白为人白蛋白。血液中的白蛋白具有运输、维持渗透压以及营养作用。体外白蛋白具有保护细胞的作用。而人白蛋白与单个核细胞均为血液成分，更有利于保护细胞，使细胞的活力更好，促进单个核细胞诱导为CIK细胞，并且得到CIK细胞用于临床，患者的排异作用小。
[0071] 根据本发明的实施例，人白蛋白的来源不受特别的限制，只要能提供人白蛋白即可，即可以来源于市售人血清白蛋白，也可以来源于人体血浆。人单个核细胞对人源性的人血清白蛋白或血浆的排异作用小，有利于冻存细胞的恢复。
[0072] 根据本发明的实施例，白蛋白的含量不受特别的限制，只要能提高单个核细胞诱导为CIK细胞的诱导效率、扩增倍数或活性即可。根据本发明的一些实施例，白蛋白的含量为1-5%或1-5。由此，复苏得到的细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。根据本发明的优选实施例，白蛋白的含量为2.5。由此，复苏得到的细胞的增殖速率更快，诱导分化效率高，细胞活性更佳。
[0073] 其中需要说明的是，白蛋白的含量即可以是体积百分比也可以是重量百分比，根据白蛋白的状态进行调整，如果是白蛋白是固态，则白蛋白的含量为1-5重量％，如果白蛋白为液态，则白蛋白的含量为1 -5体积％。
[0074] 根据本发明的实施例，右旋糖酐为右旋糖酐40。由此，有利于提高细胞的复苏效 果。
[0075] 根据本发明的实施例，右旋糖酐的含量为2-8重量％。由此，复苏得到的细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。根据本发明的优选实施例，所述右旋糖酐的含量为5重量％。由此，复苏得到的细胞的增殖速率更快，诱导分化效率高，细胞活性更佳。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液。由此，利用该冷冻复苏试剂盒复苏得到的单个核细胞，在后续的诱导过程中，诱导形成多种细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。
[0076] 根据本发明的实施例，所述免疫细胞为自然杀伤细胞和树突状细胞。由此，诱导扩增效率高。
[0077] 根据本发明的实施例，当所述激活的免疫细胞的CD56的表达超过70%时，进行第二诱导扩增培养。由此，当大部分单个核细胞诱导分化形成免疫细胞时即可进行第二诱导扩增培养，使得免疫细胞纯度进一步提升，细胞数量得到明显提高，同时扩增过程中免疫细星空体育官方入口 星空体育官网胞功能进一步增强。
[0078] 根据本发明的实施例，当所述分化的免疫细胞的CD56的表达超过90%时，进行所述第三规模化诱导扩增培养。由此，当绝大部分单个核细胞诱导分化形成免疫细胞时即可进行第三诱导扩增培养，使得免疫细胞得到进一步规模化扩增，同时保持免疫功能，为可能的临床免疫治疗提供充足的细胞。
[0079] 根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基过程中，每1天传代一次。由此，免疫细胞激活培养基过程中，免疫细胞得到明显激活，同时得到有效扩增，其他细胞比例明显降低。
[0080] 根据本发明的实施例，第二诱导扩增培养过程中，每2天传代一次。由此，第二诱导扩增培养过程中，免疫细胞纯度得到进一步提高，同时其他细胞比例进一步降低，免疫细胞功能得到增强。
[0081] 根据本发明的实施例，第三诱导扩增培养过程中，每2天传代一次。由此，第三诱导扩增培养过程中，免疫细胞在高纯度下实现规模化扩增，获得充足的功能激活的免疫细胞用于可能的临床免疫治疗。
[0082] 根据本发明的实施例，每IO6-IO9个大规模的功能激活的免疫细胞采用Iml免疫细胞冻存液。由此，能够有效实现免疫细胞的冻存，并且冻存的细胞浓度高，适于大规模免疫细胞的冻存，冻存成本低，效果好。根据本发明的具体示例，每IO7-IO8个免疫细胞采用Iml所述免疫细胞冻存液。由此，冻存的细胞浓度高，适于大规模免疫细胞的冻存，冻存成本低，并且细胞冻存效果好。
[0083] 根据本发明的实施例，冻存的免疫细胞融化后与所述冷冻复苏液按体积比为1:0.5-5进行混合。由此，保证冷冻复苏液稀释后的DMSO浓度较低，对免疫细胞的损伤小。根据本发明的优选实施例，冻存的免疫细胞融化后与所述冷冻复苏液按体积比为1:1进行混合。由此，在保证稀释后DMSO的浓度低，对免疫细胞的损伤小的前提下，冷冻复苏液的用量小，冷冻复苏的成本低。
[0084] 下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0085] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
[0087] 利用本发明实施例的免疫细胞的诱导扩增方法，将分离的单个核细胞诱导扩增为免疫细胞，并检测免疫细胞的活性。
[0090] 1.1在无菌培养瓶中加入经医用生理盐水溶解的2.5yg/mL抗人⑶16单克隆抗体5mL，轻轻晃动培养瓶使抗体铺满培养面，4 °C避光过夜。
[0093] 2.1用加入抗凝剂的无菌采血袋采集人外周血约IOOml，预留Iml外周血做快检和血型鉴定，采血袋立即无菌封装，无菌4°C保存运输，准确记录采集信息。快检筛选合格后将外周血送入GMP实验室，若快检不合格，血样废弃处理。
[0094] 2.2在GMP实验室中取出血袋，酒精消毒采血袋，观察无凝血和溶血后在超净台中打开血袋，将血液转移到至50ml无菌离心管中《40ml/管），2500rpm离心15min。
[0095] 2.3转移上层血浆到另一离无菌离心管中，3500印111离心151^11，收集上清血浆到新的无菌离心管中，用口膜密封离心管口，血细胞用于分离单个核细胞。
[0096] 2.4将血浆放到56°(：水浴锅中水浴30-5011^11灭活补体，3500印111离心151^11去除补体，IOml每支分装到15ml无菌离心管中，-20°C冻存备用；并留取7.5ml血浆进行慢检：病毒五项、支原体、内毒素和微生物，其中病毒由第三方检测为准。
[0097] 2.5将步骤2中的血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到250ml无菌玻璃瓶中，加入血液总体积1/3量的羟乙基淀粉，轻轻晃动盐水瓶使混合均匀，静置使红细胞沉降。
[0098] 2.6待红细胞层沉降分层后，将上层乳白色悬液轻轻吸取到无菌离心管，ISOOrpm离心5min，弃去上清，沉淀用IOml生理盐水重悬。
[0099] 2.7取无菌15ml离心管2支，各加入5ml常温人外周血淋巴细胞分离液，分别在上层轻轻加入各5ml细胞悬液。室温2000rpm慢升慢降离心25min。
[0100] 2.8轻轻取出离心管，小心吸取界面中间云雾层白细胞至新的15ml离心管中，补加生理盐水洗涤2次。
[0101] 2.9 Iml生理盐水重悬细胞，取5μ1细胞加入到245μ1生理盐水中稀释50倍，计数，并用台盼蓝染色计细胞存活率。实验结束的带血污物均经过配比过得新洁尔灭浸泡过夜才能丢弃。
[0104] 2.12当培养体系已经达到2L时，更换培养体系，S卩SuperCulture TM L500人淋巴细胞无血清培养基+终浓度l〇〇〇IU/ml国产IL-2，每日观察细胞，并进行适当传代。待14天时，进行细胞回收，留取IOml培养基上清进行Elisa分泌因子检测。
[0105] 2.13将回收的细胞用200ml生理盐水重悬，并加入IOml人血清白蛋白，混匀；并从中取IOml细胞悬液待检，剩余的细胞注入回输袋中准备回输。从回输袋中抽取IOml细胞悬液进行检测:支原体、内毒素、微生物和病毒五项。
[0107] 将取出的IOml细胞悬液，ISOOrpm离心回收细胞，进行流式抗体标记。设置同型对照、单标样品和染色管，每管样品细胞数约5 X 105个，然后加入对应抗体染色。4°C，30min放置，用生理盐水洗涤，然后上机检测分析淋巴细胞群中的NK细胞比例。
[0108] 4.将剩余IOml细胞悬液上清，进行分装，用以检测病毒五项、内毒素、支原体、微生物。
[0109] 5.裸鼠致瘤试验SPF级雌性BALB/c裸鼠，购于中国医学科学院实验动物研究所，4-6周龄，体重16-20g，于空气层流架中带盖鼠笼内饲养，饮用水、标准饲料及其它与动物接触品均经灭菌处理。取阳性对照Ragi细胞和K562细胞及待检测的体外诱导分化的第21天的NK细胞按3 X 107个/0.2ml接种裸鼠肋部皮下，用苦味酸标记，为期2个月观察成瘤情况。
[0114] 所述取外周血淋巴细胞分离液分离后的6 X 107个外周血单个核细胞接种到20ml培养体系中，细胞很快进入对数生长阶段。培养14d后，培养体系扩大到4L，细胞数扩增到9X 109，扩增倍数在最高达150倍，活细胞数在90 %以上，培养不同时间的外周血单个核细胞数和细胞活性的结果详见图1。
[0118] 我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、饼干抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染，结果详见表1〇
[0123] 取外周血淋巴细胞分离液分离后的9 X 107个外周血单个核细胞接种到20ml培养 体系中，细胞很快进入对数生长阶段。培养12d后，培养体系扩大到4L，细胞数扩增到6.76X109，扩增倍数在达75倍，活细胞数在90%以上，实验结果详见图3。
[0127] 我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、饼干抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染，结果详见表2〇
[0134] 裸鼠致瘤实验结果如图5所示，其中，A生理盐水对照组(成瘤小鼠数/组内小鼠数，0/5)，B Raji细胞对照组（3/5)，C K562细胞对照组(4/5)，D NK细胞组(0/5)，即在2个月观察期内皮下注射〇. 2ml生理盐水组和3 X 107个/0.2ml培养21天的NK细胞组小鼠均未见肿瘤形成，注射形同体积的Raji细胞和K562细胞的小鼠分别有3/5和4/5只小鼠形成了可见的肿 瘤。该结果说明即使培养到21天，NK细胞依然是安全有效的，不会导致肿瘤的形成。
[0136] 本实施例中，分别采用不含血浆的6种冻存液和含有血浆的6种冻存液，对实施例1体外诱导扩增的NK细胞进行冻存，比较冻存效果，以便观察血浆对NK细胞冻存保存的影响，以及降低DMSO浓度以减少细胞毒性的可能性。具体如下：
[0139] 将实施例1体外诱导扩增第10天获得的NK细胞分别采用含HSA的四种冻存液进行冻存，其中四种冻存液的成份如下：
[0147] 按照以下步骤冻存NK细胞:将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70°C程序降温过夜，次日转入液氮内。其中，每107个NK细胞采用Iml冻存液。
[0149] 检测冻存前后细胞的存活率，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】X 100%。复苏后细胞回收率的计算方法为：（复苏后活细胞数/冻存时活细胞数）X 100%。
[0151] 结果表明，复苏后细胞存活率均低于冻存前。具体地，冻存液3和4保存的细胞存活率明显优于冻存液1和2,且冻存液3和4之间未见差别，表明10体积％的01^0对NK细胞具有较好的保护作用，且不同浓度的HSA对于NK细胞的保护作用无显著差别;冻存液3和4的细胞回收率也优于冻存液1和2。冻存液5和6的细胞回收率也优于冻存液1和2,尤其是冻存液5，细胞回收率高达99.3%。
[0162] 分别采用含血浆的四种冷冻保存液，将上述体外诱导扩增10天获得的NK细胞进行冷冻保存，其中含血浆的四种冻存液的成份如下：
[0167] 冻存液13:0.2体积％的01^0+15体积％的批六+40体积％血浆，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为〇. 〇〇lg/ml;
[0168] 冻存液14:0.4体积％的01^0+10体积％的批六+40体积％血浆，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为〇. 〇〇lg/ml;
[0169] 其中，在冻存液9-14中，血楽:为自体血楽：，剩余体积的均为1640或Stemspan培养 基。
[0170] 其中，按照以下步骤冻存NK细胞:将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70°C程序降温过夜，次日转入液氮内。其中，每107个NK细胞采用Iml冻存 液。
[0172] 检测冻存前后细胞的存活率、细胞表面标志表达情况，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】X100%。复苏后细胞回收率的计算方法为：（复苏后活细胞数/冻存时活细胞数）X100%。利用流式细胞仪检测NK细胞细胞表面标志⑶3-⑶56+的表达情况。
[0174] 结果表明，六种保存液保存的免疫细胞存活率和细胞表面标志表达情况与冻存前相比无显著差别，细胞回收率高于“步骤Γ中不含血浆的冻存液。并且，冷冻保存液5和6,9和10冻存的细胞复苏后均具有一定的增殖能力，13和14冻存液冻存的细胞具有旺盛的繁殖能力。由此，表明血浆以及白酒草皂苷R对细胞有很好的保护作用。
[0182] 综上，发明人采用DMS0、HAS、白酒草皂苷R和血浆不同浓度配比，保存脐血单个核 细胞诱导的免疫细胞，观察冻存液效果，结果表明，10体积％DMSO具有较好的细胞保护作用;而不同浓度的HSA对免疫细胞的保护作用无显著差别。而采用本发明实施例的自体血浆与HSA和DMSO联用或者进一步联用白酒草皂苷R的冻存液保存体外诱导的免疫细胞，复苏后细胞回收率高，细胞活性好，具有一定的增殖能力，而其余各组冷冻液保存的细胞回收率偏低。
[0186] (1)液氮中取出实施例2冻存液7冷冻保存的NK细胞，采用37〜42°C水浴速融。
[0187] ⑵分别使用等体积的X-VIV015培养基(记为P组），以及等体积的含2.5%HSA，5%Dextran40的复苏液(记为Fl组)两种方式处理细胞。
[0188] (3)离心，分别取细胞，采用细胞活力分析仪计数，测细胞存活率。
[0190] 分别将P组和Fl组的细胞采用免疫细胞规模化扩增培养基，S卩SuperCulture TML500人淋巴细胞无血清培养基+终浓度1000IU/ml国产IL-2,进行体外培养，次日进行细胞技术和活力分析。
[0192] 由于复苏细胞时，起始细胞数不一致，需引用校正因子，计算CD3/CD56阳性细胞数。计算方法如下：
[0194] (2)使用平均值数除以各组起始细胞数，得到各组的校正因子K;
[0195] (3)将各组最终细胞数分别乘以对应的校正因子K以及⑶3/⑶56阳性百分率，即为⑶3/⑶56阳性细胞数。
[0198] “步骤Γ复苏得到的NK细胞的细胞数和细胞活力结果如表4所示。
处理复苏的细胞，两者细胞数无显著差别(p0.05)，但是细胞活力有显著性差异(p〈0.05)。结果表明，与对照组P复苏液相比，Fl复苏液能够很好的提升复苏得到的NK细胞的活力。
[0203] “步骤2”中，P组和Fl组在次日NK细胞培养的结果如表5所示。
[0206] ~由表5可见，采用培养基P或复苏液Fl处理复苏的细胞，进行24h体外培养后，两者_细胞数和细胞活力均无显著差别(P〇.05)。
[0208] 上述结果表明，NK细胞经过大规模体外培养扩增以及冻存后，采用P组和Fl组复苏液处理冷冻保存的细胞，尽管两者数量无明显差别，但Fl组处理的细胞活力高于P组，进而证明与P组普通培养基的冷冻复苏液相比，Fl组(含2.5%HSA、5%Dextran40)的冷冻复苏液能够在细胞复苏过程中，能更好的促使细胞恢复活力。
[0209] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0210] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。