肝纤维化（LF）在慢性肝病发展为肝硬化的过程中发挥着至关重要的作用，抑制肝星状细胞（HSC）活化被认为是预防LF的有效途径。七叶甙是一种羟基香豆素，它通常存在于许多药用植物中，包括七叶树、菊苣、白蜡树的树皮中，具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗菌特性。已有研究报道七叶苷在肝脏疾病治疗中的潜力。然而，目前尚无关于使用七叶苷治疗肝纤维化的研究。
采用腹腔注射CCl4诱导C57BL/6J小鼠LF模型，发现与对照小鼠相比，CCL4诱导的小鼠体重明显减轻，而经Esculin和SMT（水飞蓟宾葡甲胺片，阳性对照）处理的小鼠体重减轻明显改善，且小鼠的肝脏沉积和肝脏系数明显降低。此外，Esculin干预后均表现出剂量依赖性改善血清AST、ALT等血清标志物，说明Esculin可以改善CCL4诱导小鼠肝损伤。
接着作者评估了七叶苷对CCl4所致小鼠肝纤维化的影响，发现用Esculin治疗后纤维化标志物（血清HA，PC III和LN）水平呈剂量依赖性下降。此外，肝组织病理分析显示七叶苷治疗可改善肝组织炎症和脂质空泡化，减少胶原和纤维沉积，降低α-SMA和胶原I的表达。这些研究结果表明，七叶苷可以改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化。
研究表明，氧化应激和炎症因子是肝损伤发展的主要致病机制，且肝纤维化与铁代谢紊乱和脂质过氧化物积累密切相关。作者发现Esculin治疗显著降低炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的水平并改善MDA和SOD的水平。此外，模型组在造模后肝脏中Fe2+水平显著升高，而Esculin处理后下降。免疫荧光显示CCl4诱导后肝组织中Nrf2和GPX4的表达显著降低，而七叶苷治疗增加了肝细胞中Nrf2和GPX4的表达。结果表明Esculin通过激活Nrf2/GPX4信号通路，抑制肝脏铁死亡，发挥抗氧化和抗炎作用。
为了研究Esculin对HSC活化的影响，使用TGF-β1诱导LX-2细胞活化，并用不同浓度的Esculin处理。发现Esculin干预后，LX-2细胞形态恢复到更正常的状态，细胞增殖速率下降。此外，免疫荧光染色、WB、PCR显示Esculin处理导致α-SMA和胶原蛋白I的表达呈剂量依赖性降低，结果表明Esculin具有抑制HSC活化的能力。
5、七叶苷通过激活Nrf2-GPX4通路抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞铁死亡
GPX4是参与铁死亡的重要靶基因，受Nrf2信号通路调控，在肝脏疾病的发生发展中起重要作用。作者发现Esculin处理后，Nrf2、HO-1、NQO-1和GPX4的水平呈剂量依赖性增加，免疫荧光染色结果显示Esculin促进Nrf2易位进入细胞核，激活Nrf2/GPX4通路，导致GPX4表达增强，抑制铁死亡。结果表明Esculin激活LX-2细胞中的Nrf2/GPX4信号通路。
图5 七叶苷通过激活Nrf2-GPX4通路抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞铁死亡
为了验证Nrf2/GPX4信号通路是否是Esculin抑制HSCs活化的关键通路，作者使用Nrf2抑制剂（ML385）抑制LX-2细胞中Nrf2的转录，发现加入ML385后，Esculin组的LX-2细胞迅速扩增和增殖，添加七叶苷组的α-SMA和胶原蛋白I在添加ML385后显著升高，表明ML385可以减弱Esculin对HSC活化的抑制作用。此外，添加ML385后，Nrf2和GPX4在LX-2细胞中的表达水平显著降低，最后，分子对接、DARTS、CETSA结果显示Esculin与Nrf2之稳定结合。结果表明Esculin可以靶向Nrf2/GPX4信号通路，抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化。
图6 七叶苷抑制 LX-2 细胞活化的作用取决于 Nrf2 介导的铁死亡
该研究利用CCl 4诱导的肝纤维化小鼠模型和TGF-β1诱导的LX-2细胞模型，证明七叶苷是一种潜在的治疗肝纤维化的天然活性成分，可以抑制肝星状细胞（HSC）的活化，改善肝纤维化，机制实验证明七叶苷的治疗作用是由于其能够激活Nrf2/GPX4信号通路，抑制肝铁死亡。
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