对照试剂说明书，检查时间、温度、循环数、等是否设置正确。所选用的试剂中是否含ROX来作为参比荧光染料，用以校正仪器系统以外的物理误差，比如由于移液误差或者蒸发导致的批内体积误差等。目前市面上的预混液是不含有ROX的，当用此类试剂的时，，否则可能会出现扩增曲线异常的现象。遇到星空体育网站 星空体育首页这种问题，可以把ROX改为None，重新分析一下，结果就正常了。
还有一些多组分图扩增曲线没有抬升，但是扩增图谱的扩增曲线抬升了，这样就会与阈值线相交，反而有了CT值。这是由于软件在进行基线自动扣除的时候出现错误，引起了扩增曲线抬升。出现这种情况可以采取手动调整基线的方法，重新定义基线即可正常，即将基线起点改为荧光信号稳定的循环数（一般是3），基线终点要改成扩增曲线起峰的前一个循环数（比如起峰是在第25个循环，那基线）。引起这样的原因是由于选用的耗材、试剂或者操作的原因导致背景荧光信号有所波动，从而造成反应孔的自动基线扣除错误。
普通PCR耗材透光度比较差，会造成荧光扩增曲线异常，比如打折的扩增曲线。
目前主流荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种。如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材，则会造成耗材压扁，甚至造成机器故障；如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响酶的活性，会引起重复性不好，或者溶解曲线多峰，甚至是假阴性；
目前市面上荧光定量PCR耗材种类繁多，质量良莠不齐，在耗材选择上尽量选择品牌好一点的，切莫因为便宜选用质量差的耗材，否则会引起一系列问题。比如质量不好的耗材会引起荧光值不稳定，这会造成反应孔的自动基线扣除错误，得到不准确的CT值；
如果使用的封膜质量不好，在PCR过程中受到水蒸气的影响，容易产生变形，这样会引起光学扭曲现象。
除了耗材外，配套使用的配件也要检查是否使用正确，比如配套的8联管托架，在使用的时候只用托架的下半部分，如果忘记把上半部分取下，有可能会影响扩增
如果设置都正确，耗材及配件也都没问题，但是扩增曲线还是异常，这时候要确定下所用试剂是否正常。首先要确定试剂是否星空体育网站 星空体育首页有效，包括查看试剂是否在有效期内，是否反复冻融，运输条件是否正常。其次要观察扩增完的试剂体积，如果在扩增过程中有试剂的蒸发，可能会引起扩增曲线抬升现象，如果实验体系中加入了ROX作为参比荧光，ROX荧光可以区分扩增曲线抬升是真扩增，还是蒸发。比如反应体系存在蒸发，水分丢失，ROX浓度会增加，ROX参比荧光上抬，而正常孔中ROX荧光会一直不变。
此外还要确定下实验过程中的操作细节。比如在做标准曲线的时候是否是梯度稀释的标准品，如果不是梯度稀释标准品，可能会引起标准曲线扩增效率异常；从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀，如果试剂不是均一的，会影响后面的扩增；定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀，如果没有混匀，因为样本是水相会在上层，试剂（含有甘油成分）会在下层，在前期的PCR过程中不足以混匀完全，这样会形成折射，荧光较强，而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀，荧光就变稳定了。