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　　Sample copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 标准品 5 × 10 3 28.18 28.64 28.41 0.16 标准品 5 × 10 4 25.25 25.14 25.19 0.04 标准品 5 × 10 5 22.11 22.46 22.28 0.12 标准品 5 × 10 6 18.63 18.92 18.77 0.10 未知样品 ? 20.56 20.45 20.5 0.05 空白对照 None None 实验数据 绝对定量实验例 —— 乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量 扩增效率（ E ）计算 E=10 -1/ 斜率 － 1 =10 -1/-3.17 － 1 =2.03 － 1 ＝ 1.03 标准曲线制作： 利用 Mean Ct 作图可得到标准曲线 5×103 5×104 5×105 5×106 Copies C t 绝对定量实验例 —— 乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量 相关系数（ R 2 ）：大于 0.98 ，越接近 1 ，结果可信度越高。 扩增效率（ E ）： 0.8-1.2, 越接近 1 ，越理想。 未知样品拷贝数的计算 将 Ct 值带入线 Quantity Unknown =10 5.36 =229087 copies 绝对定量实验例 —— 乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量 X= 20.5-37.52 -3.1726 =5.36 相对定量解析方法 理论上目的基因表达量分析条件 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA 提取效率相同 细胞起始数相同 实际目的基因表达量分析 相对定量的必要性 以上条件不可能同时得到满足，必须用 内对照基因 （管家基因） 进行校正，进 行相对表达量分析。 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因 , 如： GAPDH 、 Actin 、 18S rRNA 等 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 相对定量分析 —— 管家基因筛选 0 1 2 3 4 5 6 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 实验组 实 验 值 β -Actin GAPDH β -2-microglobulin HPRT P P P O ? 双标准曲线 - △△ Ct 法 相对定量分析 —— 两种常用的分析方法 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家 基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对 表达量。 相对值 = 校正值 = 目的基因定量结果 管家基因定量结果 待测样品的校正值 对照样品的校正值 相对定量分析 —— 双标准曲线法 公式： 优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 相对定量分析 —— 双标准曲线法 检测样品 管家基因 H 目的基因 X 定量结果 定量结果 校正值 相对量 对照样品 6391.5 343.4 0.053 7 1.000 待测样品 1 8589.7 17.3 0.002 0 0.037 待测样品 2 7432.9 1946.1 0.261 8 4.874 实验数据 荧光定量 PCR 技术专题 内容概要 ? 荧光定量 PCR 的原理 ? 荧光定量 PCR 的标记方法 ? 荧光定量 PCR 解析方法 ? SYBR 法实验流程及注意事项 ? TIANGEN 公司荧光定量产品选择指南 实时定量 PCR 技术： 利用 荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中 每一个循环扩 增产物量的变化 ，通过 Ct 值和标准曲线的关系对 起始模板 进 行定量分析 与常规 PCR 技术比较： 对 PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析， 无法对起始模 板准确定量 ，无法对扩增反应实时检测 荧光定量 PCR 原理 －－ 定义 ? 扩增曲线 ? 荧光阈值 ? Ct 值 荧光定量 PCR 原理 －－ 常用名词概念 Cycle （循环数） R n （ 荧 光 强 度 ） Baseline Log － liner phase Log － liner phase 荧光基团 荧光检测元件 荧光定量 PCR 原理 －－ 扩增曲线 Cycle （循环数） R n （ 荧 光 强 度 ） Baseline Log － liner phase Log － liner phase ? 前 15 个循环信号作为荧光 本底信号（ baseline ） ? 荧光域值的缺省设置是 3 ～ 15 个循环的荧光信号的标准 偏差的 10 倍 ? 手动设置：大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段 ? 真正的信号 : 荧光信号超过 域值 Threshold 荧光定量 PCR 原理 －－ 荧光域值 Ct 值的定义： PCR 扩增过程中，扩增 产物的荧光信号达到设 定的阈值时所经过的扩 增循环次数 Cycle （循环数） R n （ 荧 光 强 度 ） Ct value 荧光定量 PCR 原理 －－ Ct 值 C y c l e n u m b e r Ck 10 4 Ck 10 2 Sample Log of DNA concentration ? 模板 DNA 量越多，荧光达 到域值的循环数越少，即 Ct 值 越小。 ? Log 模板起始浓度与 Ct 值呈 线性关系。 荧光定量 PCR 原理 －－ Ct 值与模板起始量的关系 线性关系、扩增效率确认 检测灵敏度确认 No template control 确认 PCR 扩增效率（ E ） :0.8-1.2 35Cycles 内可得到好的定量结果 如果采用 SYBR 检测方法， 30Cycles 内无非特异性产物扩增 35 Cycles 内无引物二聚体产生 相关系数（ r 2 ）：大于 0.98 荧光定量 PCR 反应性的确认 ? 定性分析研究： 杂合或纯合子鉴定，（ SNPs ）分析等 ? 绝对定量研究： 病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量， GMO 定量检测等 ? 相对定量研究： mRNA 表达量分析， siRNA 效果确认，基因芯 片结果验证，差异显示结果验证等 荧光定量 PCR 技术的应用 内容概要 ? 荧光定量 PCR 的原理 ? 荧光定量 PCR 的标记方法 ? 荧光定量 PCR 的解析方法 ? SYBR 法实验流程及注意事项 ? TIANGEN 公司荧光定量产品选择指南 非特异性荧光标记 ? SYBR Green I 特异性荧光标记 ? TaqMan Probe 常用荧光标记方法 SYBR Green I 染料法 —— 原理 SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。 SYBR Green I 热 变 性 引物退火 延伸反应 SYBR Green I 染料法 —— 作用机理 问题点： SYBR Green I 与双链 DNA 进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。 SYBR Green I 染料法 —— 问题点与关键点 关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！ 将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT) 原始图谱 对数图谱 SYBR Green I 染料法 —— 融解曲线 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确 SYBR Green I 染料法 —— 融解曲线 ? 对 DNA 模板没有选择性 适用于任何 DNA ? 使用方便，不必设计复杂 探针 ? 具有价格优势 优 点 ? 容易与非特异性双链 DNA 结合， 产生假阳性 但可以通过融解曲线 的分析，优化反应条件 ? 对引物特异性要求较高 ? 不能进行多重定量 缺 点 SYBR Green I 染料法 —— 优缺点 Taqman 探针法 —— 原理 ? 5′ 端标记有报告基团 (Reporter, R) ，如 FAM 、 VIC 等 ? 3′ 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ? 探针完整， R 发射的荧光能量被 Q 基团吸收 ，无荧光， R 与 Q 分开，发荧光 ? Taq 酶有 5′→3′ 外切核酸酶活性，可水解探针 Taqman 探针法 —— 工作机理 热变性 引物和探针与模板退火 延伸反应 探针 报告基团 淬灭基团 探针 DNA 聚合 酶 引物 R R R R 1 、引物、探针的设计： 探针 Tm 为 68-70 ℃ ， 30 bp, 5 不能有 G ， G 可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段 400 bp ，引物 Tm 为 59-60 ℃ 2 、反应参数的确定： 一般为： 94 ℃ ， 10-20S 60 ℃ ， 30-60S （ Taq 酶 5′→3′ 外切核酸酶活性在 60 ℃ 最高），也可通过 温度梯度优化退火温度 3 、优化引物和探针浓度：获得最小 Ct 值，最大信号 / 背景星空体育官方入口 星空体育官网比值 引物浓度： 50-900nM 探针浓度： 50-250nM 4 、其他与常规 PCR 相同 Taqman 探针法 —— PCR 体系的建立 3 淬灭基团 淬灭基团性质 建议使用的 5 报告基团 TAMRA 荧光物质 FAM, HEX, TET, JOE 等 Eclipse 非荧光物质 FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX 等 Taqman 探针法 —— 荧光标记物的选择 ? 高度特异性 ? 重复性好 ? 可进行多重定量 优 点 ? 只适合一个特定的目标 ? 委托公司标记，价格较高 ? 不易找到本底低的探针 缺 点 Taqman 探针法 —— 优缺点 不同定量方法的比较 方法 优点 缺点 适用范围 SYBR Green I 方法 适用性广 灵敏 方便 便宜 引物要求高 易出现非特异性带 不能进行多重定量 适合科研中对各种目的 基因定量分析，基因表 达量的研究，转基因重 组动植物的研究 TaqMan 方法 特异性高 重复性好 多重定量 价格高 只适合特定目标 病原体检测，疾病耐药 基因研究 , 药物疗效考核 遗传疾病的诊断 内容概要 ? 荧光定量 PCR 原理 ? 荧光定量 PCR 的标记方法 ? 荧光定量 PCR 的解析方法 ? SYBR 法实验流程及注意事项 ? TIANGEN 公司荧光定量产品选择指南 绝对定量解析方法 Sample 25 绝对定量的定义 ? Log （起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线 , 即得到该扩增反应存在的线性关系 ? 根据样品 Ct 值，就可以计算出样品中所含的模板量 质粒标准品的制备 PCR 目的基因克隆 质粒提取， OD 值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使 用 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 目的基因 基因组 DNA 拷贝数的计算： 待测样本浓度（ ng/ul ）＝ OD 260 × 40 ×稀释倍数 样本分子量 = 碱基数× 324 待测样本拷贝数（ copies/ul ） = 待测样本浓度 / 样本分子量× 6 × 10 14 倍比梯度稀释方法： 1v 原液 ( 标准品 i) +9v 稀释缓冲液，得标准品 ii 1v 标准品 ii+9v 稀释缓冲液，得标准品 iii 1v 标准品 iii +9v 稀释缓冲液，得标准品 iv 1v 标准品 iv +9v 稀释缓冲液，得标准品 v 质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 ? 方 法： 从血液中提取病毒 DNA ，以 TaqMan 探针法进行荧光定量检测 ? 试 剂： TIANGEN 公司探针法试剂 RealMasterMix （ Probe ）（目录号： FP203 ） ? 标准品： 质粒标准品浓度为 10 6 、 10 5 、 10 4 、 10 3 ； 2 个重复；设阴性空白对照 ? 实验步骤： 提取 HBV DNA ； 设计特异引物； 设计 TaqMan 探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中 HBV DNA 的精确 copy 数。 绝对定量实验例 —— 乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量

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