本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于快速高效扩增人b淋巴细胞体外扩增的细胞及其构建方法。
肿瘤免疫治疗是指利用生物制剂(如多肽、免疫佐剂、细胞因子、单克隆抗体等)直接或者间接的激发和增强抗肿瘤免疫应答和打破肿瘤免疫抑制效应，抑制肿瘤的生长或者直接杀伤肿瘤细胞。它是除了手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术，近几年进展快速，已逐步进入临床应用。
tcr-t免疫治疗是特异性肿瘤治疗中的过继性细胞免疫疗法。选择患者所带有的一种或者多种肿瘤抗原作为过继细胞治疗的靶标，获得肿瘤抗原表位及特异性tcr序列，利用基因工程技术，将编码抗原特异的tcr基因序列转染至患者自身的t细胞，使普通淋巴细胞转变为特异性识别肿瘤抗原的t淋巴细胞，大量扩增后回输至病人体内以达到杀伤肿瘤细胞的目的。肿瘤过继t细胞治疗的靶标为各种肿瘤抗原，克隆肿瘤抗原特异性tcr是tcr-t细胞治疗研发的重点。制备各种抗原提呈细胞是研发的基础。
抗原提呈细胞在免疫应答中位于初始环节，在克隆肿瘤抗原特异性tcr的过程中至关重要。抗原提呈细胞是一群在免疫应答中，摄取、加工、提呈抗原并激活下游t细胞的免疫细胞亚群。主要包括巨噬细胞、b细胞和树突状细胞(dendriticcell，dc)。
dc是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，但dc在pbmc中所占百分比不到1％，而且他们很难体外培养扩增并且寿命有限。因此dc细胞的数量很难满足科学研究与临床应用的大量需求。
b淋巴细胞通过表面所表达的高亲和力b细胞抗原受体(bcr)能够有效地摄取、内吞和加工抗原。b细胞同时表达mhc-i、ii分子，以及t细胞激活所需的共刺激分子，形成免疫突触，将抗原提呈给mhc分子，识别抗原后，可有效刺激t细胞活化。
b细胞在体外拥有扩增的潜能，虽然在普通的培养液中不能生存与扩增，但是特殊的条件下能够扩增。因此，b细胞可以作为优良的抗原提呈细胞，在体外大量扩增，用于肿瘤抗原特异性免疫治疗的研发。
b细胞表面表达cd40分子，在cd40配体(cd40l)作用下给b细胞提供生存的信号；baff分子为b细胞活化因子，能够增强b细胞的存活；il21为b细胞的生长因子。这些分子的不同组合用于在体外培养扩增b细胞。
但是现有的体外培养扩增b细胞的方法，b细胞在体外不能单独存活，需要额外添加很多生长因子或激素，并且b细胞产量较低，例如cn2.8可溶性cd40l刺激人外周血b细胞长期培养方法，需要添加胰岛素。在研究抗肿瘤t细胞体外刺激过程中，抗原提呈细胞是一个限速因素，限制了tcr-t免疫治疗的发展和应用。
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于快速高效扩增人b淋巴细胞体外扩增的细胞及其构建方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于快速高效扩增人b淋巴细胞体外扩增的细胞。
本发明的第二个目的是提供一种所述细胞在快速高效体外扩增人b淋巴细胞中的应用。
本发明首先要求保护一种用于快速高效扩增人b淋巴细胞体外扩增的细胞，所述细胞为过表达cd40l基因(cd40配体基因)、il21基因和baff基因的贴壁细胞。
优选地，所述细胞的制备方法为，利用慢病毒转染体系，先构建过表达cd40l基因(cd40配体基因)和il21基因的重组细胞，再转入baff基因。
更优选地，所述细胞的制备方法为，利用慢病毒转染体系，先构建携带cd40l基因和il21基因的重组细胞的慢病毒载体，转染受体细胞，得到重组细胞；再构建携带baff基因的载体，电转之前得到的重组细胞，得到所述细胞。
进一步，本发明要求保护一种快速高效体外扩增人b淋巴细胞的方法，包括以下步骤：
s1.将所述细胞弃去培养液，加入含有丝裂霉素c的含有10％(体积单位)fbs的dmem培养液，培养2小时，培养液中丝裂霉素c的终浓度为50～150μg/ml；
优选地，步骤s1中，使用六孔板培养，所述细胞(7～9)×105/孔铺板，b细胞以(2～5)×104/孔加入步骤s3获得的已贴壁的细胞上。
更优选地，所述细胞用量为8.5×105/孔，b细胞的用量为2×104/孔。
s1.将所述细胞弃去培养液，加入含有丝裂霉素c的含有10％(体积单位)fbs的dmem培养液，培养2～3小时，培养液中丝裂霉素c的终浓度为100μg/ml；
s3.用胰酶消化细胞后，将8.5×105/孔铺在六孔板上，贴壁生长后去除培养液；
本发明将cd40l，baff和il21基因转入贴壁细胞系中，以改造贴壁细胞，建立了快速高效扩增b细胞的技术。本方法不需要加入外源细胞因子，就能在短时间内快速大量的体外扩增人b细胞。比传统的3t3-cd40l和293t-cd40l-sbaff方法提高b细胞产量5～10倍，时间缩短三分之二，而且可明显降低实验费用。本发明能在短时间内快速大量的体外扩增b细胞，用于t细胞刺激的抗原提呈，刺激肿瘤相关抗原与特异性抗原t细胞的扩增与分离。本发明的特点是快速高效，在刺激病人t细胞，产生肿瘤抗原特异性t细胞过程中，速度和效率非常重要，需要尽快分离扩增抗癌t细胞以便开展抗癌t细胞免疫治疗。快速扩增的b细胞，用作为抗原提呈细胞与dc前后刺激t细胞，使其活化，产生免疫应答。本方法不但能够使b细胞作为apc，加载抗原性性肽，以刺激抗原特异性t细胞的扩增，为分离抗癌t细胞以及相应的tcr基因提供了基础；而且可以用于分析b细胞的功能，自身免疫性疾病中b细胞的状况，以及克隆抗原特异性单星空体育网站 星空体育首页克隆抗体。本技术的建立与推广，将有利于推动中国癌症病人的特异性免疫治疗(tcr-t)的开发与应用。
图3为b细胞在不同饲养层细胞上培养的生长曲线为b细胞的形态和分子标志鉴定。
图6为用b细胞提呈肿瘤相关抗原肽段，诱导t细胞产生特异性免疫反应的实验。
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
将人工合成的人cd40l基因克隆入psin-ef2慢病毒载体中，得到慢病毒表达载体psin-ef2-cd40l。
将293t细胞铺在六孔板上，待细胞铺满70％～80％后，将携带目的基因的慢病毒表达载体psin-ef2-cd40l和psin-ef2-cd40l-il21分别连同两个包装载体(2μgpspax2+2μgpmd2g)，通过lipofectamine3000transfectionreagent转导293t细胞以产生慢病毒，转导后的48小时收取第一批含病毒的细胞上清液。病毒液经过0.45μm的滤器过滤后，可使用100kd(或更小孔径)的蛋白浓缩柱浓缩慢病毒。
用上一步构建的两种慢病毒分别转染3t3细胞，消化3t3细胞并计数，按每0.5ml的病毒浓缩液加入0.5ml3t3细胞完全培养液混合，加入终浓度为8～12μg/ml的凝聚胺(polybrene)溶液，可转染1×10
个3t3细胞。实验组混合病毒液，培养基和细胞，混匀放入15ml离心管中；对照组则用等体积的完全培养基代替病毒液转染3t3细胞。混合完成后，把实验组和对照组置于37℃培养箱中孵育。9小时后，培养液用1200rpm离心3分钟，去除上清，并用0.25％的胰酶消化成团的3t3细胞。充分分散成单个细胞后用培养液重悬，种在25t培养瓶上，36小时后对实验组和对照组进行筛选。四、3t3-cd40l和3t3-cd40l-il21细胞的筛选
转染24小时后可以加入含1μg/ml终浓度嘌呤霉素的完全培养液中进行筛选。每天更换培养液，通常5～7天可以看到对照组细胞完全死亡，而实验组有3t3-cd40l细胞存活并形成小克隆。3t3-cd40l和3t3-cd40l-il21细胞长大后可以挑取单克隆。准备消毒好的细胞克隆环、手术器械和凡士林。在显微镜下找到要挑取的克隆，用记号笔在细胞皿的背面标记。挑取时，在超净台里打开细胞皿的盖子，吸走皿内的培养液。用镊子夹起克隆环，在底部粘上凡士林，圈住标记好的克隆，并轻微按压，让环内形成封闭空间。在克隆环内滴入适量胰蛋白酶，消化3分钟后吸出放入96孔u底板中进行中和。处理完所有克隆后1200转离心5分钟，弃掉上清后重悬进行扩增培养。
3t3-cd40l细胞用流式细胞术鉴定cd40l的表达：收集细胞，用pbs洗涤后重悬细胞，取两组1×10
细胞，一组为实验组，一组为对照组。将两组各重悬细胞于400μl的pbs，将细胞等分成两部分，实验组加入2μlcd40l抗体，对照组用同型抗体(isotype)做阴性对照染色。室温避光孵育20min，pbs洗涤两次后重悬细胞，用bdfacscanto流式仪检测染色的细胞，用同型抗体染色的细胞设定各种条件荧光抗体的检测参数(激光电压等)，设定条件后检测实验组的细胞。用bdfacscanto软件和flowjo软件分析流式检测数据，检测cd40l有无表达。3t3-cd40l-il21细胞用elisa法检测il21的表达：收集上清后用酶联免疫吸附测定法来测定上清中细胞因子的浓度。具体操作步骤：(1)包被：取所要包被的物质(包被缓冲液+包被抗体)，提前计算所需浓度，通过包被孔数计算所需包被物的量，包被液稀释，分60l加至各孔，置4℃过夜。(2)洗涤：丢弃包被液，加pbs静置5－10min后弃掉洗液，重复3－5次，最后拍干elsa板。(3)封闭：加封闭液封闭elisa孔，体积为包被液的两倍。37℃孵育2－4h。(4)洗涤：洗涤封闭的elisa板，加入一抗60μl，37℃孵育2h。(5)洗涤：具体同步骤2。(6)加二抗：将二抗加入60μl至各孔，37℃反应1－15h。(7)洗涤：具体同步骤2：(8)显色：取60μl显色液加入elisa各孔中，置于37℃反应10min。(9)终止：将elisa板取出，每孔加终止液60l(2moll硫酸溶液)终止反应，立即到酶标仪上读数，记录450mm处的od值。(10)通过建立标准曲线、实验结果
用流式细胞术鉴定cd40l结果如图2a所示，3t3-cd40l细胞系的表面可表达cd40l。
(1)质粒线性化及电转前准备：线μg质粒载体dna，用适当的限制性内切酶线性化酶切。纯化dna后溶解于无菌水中。测量线性化后的质粒dna浓度，并调整至1μg/μl的浓度。
(2)消化3t3-cd40l-il21细胞，上下吹散细胞以确保细胞成单细胞悬浮液。离心1000rpm3min,用pbs重悬后计数。
/组3t3-cd40l-il21细胞，离心后去上清，用配好的悬液重悬，加入电转杯(注意避免气泡)。3t3细胞电转条件，将电转仪调至a024。
(5)将电击后的细胞用细胞培养液重悬，转入25t培养瓶中。48小时后，换液，加入药物zeocin以600μg/μl的浓度进行筛选。半个月后可以看到对照组3t3-cd40l-il21细胞完全死亡，而实验组有3t3-cd40-il21-baff细胞存活并形成小克隆。挑取单克隆进行扩增鉴定。二、流式细胞分析鉴定baff的表达
用流式细胞术鉴定baff的表达的结果如图2b所示，3t3-cd40l-il21-baff细胞表面有baff基因的表达。
采集健康志愿者的血液，用ficoll密度梯度离心法分离pbmc(外周血单个核细胞)，获得淋巴细胞。cd19分子是b细胞表面特有的分子标记，用dynabeadscd19磁珠特异性地标记pbmc细胞(1.0×10
b细胞和饲养层细胞的共培养过程：(1)弃去构建好的3t3-cd40l-il21-baff饲养层细胞培养瓶中的培养液，加入适量含1μg/ml丝裂霉素c的培养液(dmem+10％fbs)，放入培养箱2小时。(2)丢弃含有丝裂霉素的培养液，加入适量pbs，轻轻摇晃，弃去pbs，重复洗3－5次(洗3次以上，彻底洗去残存的丝裂霉素。(3)用胰酶消化饲养层细胞，将细胞以8.5×105/孔铺在六孔板上，贴壁后去除培养液，b细胞以2×10
/孔加入饲养层细胞上，培养液为imdm+10％(体积分数)人ab血清+100u/ml青霉素+100μg/ml链霉素+100μg/mlhepes+0.1mmmemneaa+1mm丙酮酸钠。每3天更换一次饲养层以及b细胞传代。b细胞与经过丝裂霉素处理2个小时后的饲养层细胞3t3，3t3-cd40l，3t3-cd40l-il21和3t3-cd40l-il21-baff共培养，每隔3天收集b细胞，计数不包括台盼蓝阳性的死细胞，数据来自三个健康志愿者的b细胞在相同条件下培养的平均值。二、实验结果
结果显示，经过十天刺激后，与3t3共培养的b细胞数量一直下降，与3t3-cd40l共培养的b细胞扩增了12倍，与3t3-cd40l-il21和3t3-cd40l-il21-baff共培养的b细胞分别增长了25倍和97倍(图3)。前4天，这四组的b细胞没有太大差异，从第4天后，b细胞与不同饲养层的细胞共培养扩增的速度有明显差异，在3t3-cd40l-il21-baff里共培养的b细胞增长速度和数量明显高于其他三个组，在第10天，差距达到了顶峰。说明3t3-cd40l-il21-baff细胞系在体外扩增b细胞的效率最高。使用配对t检验，n＝3。p0.05表示统计学显着性差异。*表示p0.05；**表示p0.01；***表示p0.001。利用实施例2构建饲养层细胞(3t3-cd40l-p2a-il21-baff细胞)的扩增后的b细胞形态与验证见图4，b细胞在饲养层细胞表面成簇扩增，收集b细胞，用流式细胞分析的方法能检测到b细胞表面特有的cd19的表达。
/每孔，培养液为rpmi1640+10％自体血清+20u/mlil-2，并加入合成的肿瘤相关抗原kk-lc-1长肽(5μg/ml)，置于37℃，5％co2培养箱中培养7天，3天后换液一次并补充细胞因子，依靠pbmc自身中的不同apc如dc、巨噬细胞等进行多肽的提呈。第二轮刺激：用实施例3培养得到的b细胞提呈抗原，将第一轮刺激扩增后的t细胞与mdc以1:1的比例继续加肽(5μg/ml)刺激培养，置于37℃，5％co2培养箱中培养7天，3天后换液一次并补充细胞因子。第三轮刺激：重复第二轮步骤。用刺激三周后的t细胞通过酶联免疫斑点法(elispot)检测抗原激活的t细胞反应性指标(ifn-γ的分泌与cd137上调)反应。
第一天：接种细胞，加入长肽培养。具体操作步骤为：(1)预包被板的活化：每孔加入200lrpmi－1640培养液，静置5～10分钟后将其吸出；(2)加细胞悬液：将t细胞(1.0×10
个/孔)置于预包被的elispot试剂盒培养孔中，用rpmi1640进行培养，100μl/孔。实验组加入多肽(5μg/ml)，对照组孔不加肽，阳性对照孔加入植物血凝素(phytohaemagglutinin,pha)；(3)孵育：样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入37℃，5％co2培养箱培养16～20小时。第二天：培养后操作。具体操作步骤为：(1)裂解细胞：倾倒孔内液体。加入冰冷的去离子水200μl/孔，放置4℃冰箱10min后低渗裂解细胞；(2)洗板：倾倒孔内液体，加入1washingbuffer，200il/孔，洗涤5－7次。每次停留60秒。最后一次在吸水纸上扣干；(3)检测抗体孵育：将生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100μl/孔，37℃孵育1小时；(4)洗板：倾倒孔内液体，加入1×washingbuffer，200μl/孔，洗涤5次；(5)酶联亲和素孵育：将酶标亲和素工作液加入实验孔，100μl/孔，37℃孵育1小时；(6)洗板：倾倒孔内液体，加入1washingbuffer，200μl/孔洗涤5次；(7)显色：将aec显色液加入实验孔，100μl/孔，37℃孵箱孵育10分钟显色；(8)终止显色：倾倒孔内液体，用自来水洗涤条板3～5遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处自然晾干；(9)elispot板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。2、实验结果
结果显示，用b细胞加载抗原长肽刺激t细胞，实验组的t细胞经b细胞提呈的长肽刺激后呈现比对照组更明显的细胞聚团现象(图5)。与只有t细胞和b细胞的对照组对比，实验组加载肽的t细胞释放ifn-γ斑点数显著增高(图6a)。说明经过本发明方法扩增的b细胞可以有效提呈抗原给t细胞，能够刺激出针对肿瘤相关抗原肽的特异性t细胞。
活化的t细胞上调cd137表面标志，而且具有抗原特异性。cd3/cd4/cd8/cd137表面标志流式染色可以检测t细胞活化的亚群。hlai类长肽通常诱导cd8+t细胞活化，产生免疫学反应。用流式细胞技术检测cd8+和cd4+t细胞分群以及cd137表面标志变化。将t细胞(1.0×10
个/孔)置于96孔板中，用rpmi1640进行培养。实验组加入多肽(5μg/ml)，对照组孔不加肽。20～24h后，实验组和对照组各重悬细胞于400μl的pbs，将细胞等分成两部分，一部分加入2μl不同荧光标记的cd3，cd4，cd8和cd137抗体，另一部分用同型抗体(isotype)做阴性对照染色。室温避光孵育20min，pbs洗涤两次后重悬细胞，用bdfacscanto流式仪(美国bdbioscience公司)检测染色的细胞，用同型抗体染色的细胞设定各种条件荧光抗体的检测参数(激光电压等)，设定条件后检测实验组的细胞。用bdfacscanto软件和flowjo软件分析流式检测数据，确定cd3+cd4+cd137+以及cd3+cd8+cd137+的t细胞亚群分布情况。2、实验结果流式检测结果(图6b)显示加肽的实验组中cd137阳性表达cd8+t细胞对比不加肽组均有显著增高。刺激结果提示长肽被吞噬加工提呈到细胞表面，可以刺激抗原特异性t细胞活化，产生扩增反应。说明通过本发明方法扩增的b细胞功能正常，可以行使抗原提呈功能。
120一种用于快速高效扩增人b淋巴细胞体外扩增的细胞及其构建方法
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