DNA 溶解曲线表示扩增产物的特异性。 曲线横坐标就是温度,每个温度点一个。一般从 60 到 98 度纵坐标就是荧光强度的变化值(不就是强度本身)。 一开始加热的时候,虽然荧光强度比较强,但就是由于双链没有解离,所以荧光强度保持不变。 当加热接近于 PCR 产物 Tm 时,双链开始解离,荧光强度变小,机器会比较前后 2 个温度点的荧光强度,然后把 2 者的差值标在图上。 Tm 到达时,有一般双链解离,这时的荧光强度变化最大(峰值)。再加热,双链全部解离,所以荧光强度的变化又变小了。 您 PCR 产物大小不一,但就是只要有相同或者相近的 Tm,峰值就有可能在一个位...
DNA 溶解曲线表示扩增产物的特异性。 曲线横坐标就是温度,每个温度点一个。一般从 60 到 98 度纵坐标就是荧光强度的变化值(不就是强度本身)。 一开始加热的时候,虽然荧光强度比较强,但就是由于双链没有解离,所以荧光强度保持不变。 当加热接近于 PCR 产物 Tm 时,双链开始解离,荧光强度变小,机器会比较前后 2 个温度点的荧光星空体育 星空体育平台强度,然后把 2 者的差值标在图上。 Tm 到达时,有一般双链解离,这时的荧光强度变化最大(峰值)。再加热,双链全部解离,所以荧光强度的变化又变小了。 您 PCR 产物大小不一,但就是只要有相同或者相近的 Tm,峰值就有可能在一个位置上。如果实际测得的峰值与理论计算的吻合,问题不大。如果有差别,说明有非特异性产物,建议不要再用 SYBR GREEN 方法。 标准的 PCR 过程分为三步: 1、DNA 变性 (90℃-96℃):双链 DNA 模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链 DNA 2、退火 (25℃-65℃):系统温度降低,引物与 DNA 模板结合,形成局部双链。 3、延伸 (70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5端3端延伸,合成与模板互补的 DNA 链。 每一循环经过变性、退火与延伸,DNA 含量即增加一倍。 1、随着温度的升高,DNA 双链断裂;接着温度降低,到达退火温度的时候,DNA 双链复性,荧光分子绑定在 DNA 双链上,所以荧光信号值到达最高点。上面的就是反映在扩增曲线上面的。 如图所示,这就就是一个标准的 real time-qPCR 溶解曲线。下面从几个方面来解读: 2、接着 DNA 双链分子由退火温度约 60 度,继续升温,双链断开,DNA 分子溶解。 请注意溶解曲线的纵坐标,表示单位时间内荧光信号的变化量。 当扩增产物特异,就是单一产物的时候,这个纵坐标峰值所对应的横坐标应该就是一致的,即呈现单一的溶解峰,这个时候,在同样的温度下,可以认为就是产物相同; 如果溶解峰不单一,就意味有非特异性扩增。