很不好意思在这里问些白痴问题,只因为我的毕业实验要用real-time PCR 来检测,但由于种种原因我是送出去给公司做的,
2、做的扩增曲线没有明显的指数增长期、线性增长期、平台期,而且不够平滑,帮忙看看扩增曲线能否通过评审?
“扩增的是40循环,而不是永无止境扩增下去,所以看不到平台期。做的实时量PCR(FQ-PCR)是终前检测,不是终后检测,所以也不需都要达到平台期。如果从审美观点上可能不是很好看,但这不会影响结果。使用是染料法做,曲线最后面肯定有个折线,因为这是机器正在采溶解曲线,这也是做染料必须有的曲线。
realtime PCR的结果是不需要电泳图的,但你的扩增曲线是没法用的。
realtime PCR的核心数据就是扩增曲线,它不仅反映了CT值,更重要的是反映了整个PCR的扩增质量,而ct值必须依据一个良好的扩增质量才能作为ct值来确定,所以,如果你的扩增曲线不好的话,即使得到了ct值,这个值也是不可靠的,在科星空体育登录入口 星空体育在线官网学研究上,不可靠的数据是不能作为实验结果来达到你的实验目的。
1.因为染料法最后做融星空体育登录入口 星空体育在线官网解曲线,所以理论上不用跑胶,从融解曲线上就可以分辨特异性了(从你的融解曲线条存在非特异性扩增);
2.似乎只有HGF的平台期不明显,其他都还可以。不明显的原因一是跟起峰晚有关(28左右才起峰),二是扩增效率明显不如其他(可能是体系的原因)。至于曲线最后一个循环的折线,我个人认为厂家的说法说不通,既然说做融解曲线都这样,为何标准外参照的扩增动力学曲线没有这一折线。我做定量PCR时也做融解曲线,但分析软件会把融解曲线和扩增曲线分开,没有出现过这种状况。
