在生物制药细胞培养工艺开发中，工艺放大一直是一个需要全面考量的工作。如何能将在小规模培养时优化的工艺直接顺利过渡到更大规模的体系，且既能使结果重现、又能减少重复优化成本？本期将讲解如何使用CEL-G® Culture Ad60固定床生物反应器来实现简单高效的细胞培养工艺放大，展示了我们从1m2扩大到 60m2培养面积的放大研究案例。
生物工艺开发早期，通常是在小规模体系中进行的，这有助于节省时间、成本和资源。但随着开发进程的推进，生物制药公司需要更多的样品来进行表征、试验和最终的商业化，工艺开发需要过渡到中试/生产规模。这一过程中，保持稳定的产量和产品特性非常关键，这就需要在不同的规模上重现细胞的生长环境。
在传统的搅拌式生物反应罐(STR，Stirred-tank Reactor)中，各种参数定义了细胞的生长环境，如营养物的浓度和分布、溶解氧和二氧化碳的浓度以及机械剪切力等。这些参数则受到生物反应罐的性能影响，如体积传质系数（kLa）、桨叶类型和通气装置，以及工艺参数如搅拌速度和气体流速等。在放大规模的研究中，通常保持其中一个工艺参数不变，再改变其他工艺参数。
固定床生物反应器(FBR，Fixed Bed Reactor)是专门为贴壁细胞培养应用而设计的生物反应器。其核心是使用片状载体或规整式的载体结构填充进反应器中，可以实现在一个较小的生物反应器体积中提供一个较大的细胞生长表面积。采用STR进行培养时，细胞悬浮在液体培养基中，并通过搅拌不断混匀，剪切力较大；在 FBR中，细胞贴附生长在固体但多孔的基质中，细胞不会在FBR中移动，而是通过搅拌在整个固定床基质中循环含有营养物质的培养基，从而使细胞获得营养物质，且剪切力低。
同腾新创自主研发的Ad60 FBR（图1），是一款规整式固定床生物反应器，主要用于贴壁细胞的培养及产物收集，适用于病毒疫苗，细胞和基因治疗，外泌体生产等领域。其独特的瀑布流设计能完成高效的气质传递、为细胞生长提供低剪切力的3D培养环境。各种规格的固定床结构均具有相同的瀑布式流体条件，涵盖了工艺参数开发、中试临床验证、商业化生产多个环节，在整体工艺上实现了无缝稳定的规模放大。
Ad60 FBR配有内置磁性驱动叶轮，使培养基从底部到顶部流经整个固定床，可以确保低剪切力和高细胞活力。在固定床的顶部，培养基在流下时会形成一层薄薄的液膜，形成类似瀑布流的现象，该过程也称为降膜[1]。由于液膜厚度极小，降膜过程中，气体以较高的效率进出液体，从而完成气体交换。根据实际培养情况，可通过调节气体流速、降膜高度和降膜速度调节气体传递速率（图2）。
规整式FBR 是目前可用于培养贴壁细胞的最具放大性的技术。与横向规模扩展而不是空间规模放大的 2D 扁平培养器皿不同，Ad60 FBR 有许多不同的尺寸可供选择。同腾新创Ad60 FBR，单台主机适配BT-2、BT-20、BT-60三款不同规格的反应器，培养面积从可涵盖1m2-60m2范围（图3）。
固定床层高度：固定床的床层高度是有极限的。增加床层高度的主要限制源于营养物浓度不可避免的轴向梯度。通常限制床层高度的物质是氧气。固定床层的高度取决于通过它的表观流体速度、细胞密度和比耗氧率。有研究[2]通过计算推断出可以实现的固定床层高度在 5-30cm的范围内[3]。
固定床层直径：固定床层的最大直径受到在整个横截面上培养基能否均匀分布的限制，直径过大可能发生窜流并导致培养基分布不均。以结构与固定床相似的色谱柱进行类比，推测固定床反应器的直径范围与大型色谱柱类似，最高可达 2m[3]。
固定床反应器气体交换方式：无需底部进气，仅通过瀑布流现象，就可达到高效的气体传递速率。从而可以确保更低的剪切力和更高的细胞活力。
固定床层的高度、直径等因素可能影响培养基的流动和分布，进而间接影响细胞生长。同腾新创开发的实验室规模的Ad60 FBR和商业化规模的Ad600 FBR可提供不同高度和直径的固定床载体，可实现按固定床等高或等直径策略的灵活放大。
流经固定床层的培养基线速度是FBR细胞培养放大的一个重要参数, 它不仅决定了剪切力的大小，而且会影响营养物质的分布和氧气的传递。在Ad60 FBR中，培养基线速度由搅拌转速和培养基体积决定，同腾新创的研发人员已通过测试确定了不同规模固定床运行时的线速度表，可为用星空体育网站 星空体育首页户工艺放大研究提供基础的参数。
在进气量固定的情况下，Ad60 FBR的 kLa 由培养基线速度与降膜高度决定，其中降膜高度由反应器内的液体体积决定。反应器中培养基体积越大，达到同一线速度所需的搅拌转速越低，但同一线速度下的 kLa 也越低。为保证反应器内细胞正常生长，需要确定培养基体积、培养基线速度和氧传递系数 kLa 之间的关系。同样的，同腾新创将为终端用户提供不同规模固定床运行时的kLa参考表，帮助用户顺利进行工艺的放大研究。
如何在不同规模的固定床上再现细胞生长环境：维持培养基通过固定床的线速度不变，使得不同规模的FBR可保持相似的细胞培养微环境。
放大规模时，保持其中一个结构参数不变，在从1m2放到到20m2固定床时，保持相同的高度5cm，仅直径放大。从20m2放到到60m2固定床时，保持相同的直径，仅高度放大至15cm（图4）。
放大规模时，通过保持相同的培养参数（温度、pH、DO）、相同的细胞密度（总培养基体积和总面积的单位细胞密度）、以及相当的线速度，可确保放大的一致性。
图4. Ad60 FBR的主机分别配置1㎡（左）、20㎡（中）、60㎡（右）固定床
不同规模的固定床中细胞生长和代谢研究：我们在工艺放大研究过程中对固定床中细胞密度（取样条取样），游离细胞量（上清取样）和细胞代谢（上清取样）进行检测，实验结果表明，采用5×103 cells/cm2低密度接种，从1m2到60m2固定床可以实现细胞生长的等速放大，且最高细胞密度均可达到4.5×105 cells/cm2以上，即细胞在固定床上扩增了近100倍。通过游离细胞检测发现，细胞在固定床中脱落率低，不超过1%。对培养过程中的葡萄糖、乳酸和乳酸脱氢酶（LDH）含量的检测发现，通过培养基换液可使细胞保持良好的的代谢水平，从而保证了细胞的增殖能力，且20m2和60m2固定床中的细胞代谢波动比1m2固定床更稳定（图5）。
不同规模的外泌体产量研究：分别于Day5、Day7、Day9进行细胞上清原液的全收获，对起始培养基和收获的细胞上清液用纳米颗粒追踪分析仪（NTA）进行外泌体颗粒数检测。结果显示Day5收获的上清中外泌体颗粒数已达到3E10/ml，且换液后外泌体颗粒数仍逐步升高，这和细胞能正常增殖和保持良好的代谢水平相关，同时20m2、60m2固定床培养的细胞上清中外泌体颗粒浓度也与1m2固定床的水平相当（图6），说明在不同规模固定床中放大培养后产量的可比性高。
固定床内细胞分布均一性研究：293T细胞在1m2和60m2固定床上生长，每天抽取一根取样条计数，将取样条均分成3段，分别计数每一段取样条中细胞数，结果显示在培养过程中，细胞在轴向上分布均匀（图7）。293T细胞在60m2固定床上生长9天后，分别在固定床双层PET膜的内膜和外膜的外-中-内部位轴向贯穿剪裁一根固定床样品，并将样品分成上、中、下三份裂解后进行细胞计数，结果显示不同部位细胞分布均匀（图8）。
从1m2到20m2和60m2，固定床不仅可以实现细胞生长的等速放大，且各规格固定床中的细胞代谢水平一致性高，细胞在固定床内分布均匀，规模放大后可以保持恒定的产量。Ad60 FBR通过相似的培养基通过固定床的线速度，可使不同规模的固定床反应器进行工艺转移更为简单高效，无需进行工艺优化的额外步骤，即可保持相似的细胞培养微环境，从而简化和加速了从研发工艺到临床和商业生产的转移及放大过程，并有效降低了放大的风险。