细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算-课件【PPT演讲稿】.ppt
1. MTT 比色法测定细胞生长曲线 级生物医学工程(工) 2120220205 2017-1-21 1. MTT 比色法测定细胞生长曲线 细胞生长曲线?细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法,也是判定细胞活力的重要指标,是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后,经过短暂的悬浮然后贴壁,随后度过长短不同的迟缓期(潜伏期) ,即进入大量分裂的对数生长期。在细胞达到饱和密度后,停止生长,进入稳定期, 然后退化衰亡。以存活细胞数(万/mL) 对培养时间(h或 d)作图,即得生长曲线。一般而言,我们主要研究的是对数生长期的生长曲线 测定细胞生长曲线的方法 (简单、最常用、有误差) ?(1)传代后把细胞重悬,得到细胞悬液,把悬液均匀加到 24孔板中?(2) 24 h 后开始进行细胞计数,以后每隔 24 h 计数一次,每次取 4孔细胞, 分别进行计数,计数结果取 4孔的平均值。连续计数 6天。?(3)根据细胞计数结果,以单位细胞数(细胞数/mL) 为纵坐标,以时间为横坐标绘制生长曲线 法(复杂,误差小) ?原理? MTT :全称为 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide ?汉语化学名: 3-(4 , 5-二甲基噻唑-2)-2 , 5-二苯基四氮唑溴盐?商品名:噻唑蓝,是一种黄颜色的染料。?活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶能够使外源性的 MTT 还原,同时在细胞色素 C 的作用下,生成不溶于水的蓝色(或蓝紫色) 络合物甲臜。?按照时间间隔,通过酶联免疫检测仪在 490nm (或 570nm )波长处测定甲臜的光吸收值( A值) 。?在通常情况下,甲臜生成量与活细胞数成正比, 因此可根据光吸收值推算出活细胞的数目。?由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶,因此加入 MTT 不会有反应。? 2017-1-21 ? :?例如: 用培养液将待检细胞重悬,得到细胞悬液,按照 4x10^4/ml 细胞密度梯度 ,分别接种于 96 孔板 ,每孔 100 μ l,重复 3孔;采用 MTT 法测量吸光值 A值,同一浓度下测得的 A值为该浓度下 3孔的平均值。?依检测结果 ,得到吸光值 A值与细胞浓度的对应关系,绘出标准曲线。? :?例如: 用培养液将待检细胞制成 1 10 ^4 /ml 的细胞悬液;分别接种于多块 96孔板 ,每孔 100 μ l ;在 24 、 48 、 72 、 96 及 120 h 时间点取一块 96 孔板 ,采用 MTT 法测量吸光值 A值得到吸光值 A值与时间的关系。??根据标准曲线计算出相应的细胞数 ,再绘出细胞的生长曲线 ?曲线拟合?曲线拟合( curve fitting )是指选择适当的曲线类型来拟合观测数据,并用拟合的曲线方程分析两变量间的关系。? SPSS ? SPSS 是世界上最早的统计分析软件,由美国斯坦福大学的三位研究生 N星空体育 星空体育平台orman H. Nie 、 C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent 于 1968 年研开发成功, 同时成立了 SPSS 公司,并于 1975 年成立法人组织、在芝加哥组建了 SP星空体育 星空体育平台SS 总部。? 1984 年 SPSS 总部首先推出了世界上第一个统计分析软件微机版本 SPSS/PC+ ,开创了 SPSS 微机系列产品的开发方向,极大地扩充了它的应用范围, 并使其能很快地应用于自然科学、技术科学、社会科学的各个领域。 2017-1-21 ?通常地,细胞生长曲线的函数拟合模型是?但由于细胞增值是二次分裂生长,所以选用?作为细胞生长曲线的拟合模型更为合适。 b t Y a e ?2 b t Y a ? 2017-1-21 ?又因为在 SPSS 中的曲线拟合功能选项中并没有的函数拟合模型,只有?于是我们可以通过变换?从而能使用 SPSS 中的函数拟合模型进行曲线 b t Y a ? ln 2 ln 2 b t b t a e a e ? ? 2 b t Y a ? b k a e ?( ln 2) k t ?其中 tY b a e ?
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