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1、mtt法观察细胞生长曲线 mtt法绘制生长曲线 一 细胞生长曲线： a、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观看细胞生长基本规律。 b、背景学问 细胞生长曲线是观看细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观看细胞生长变化的试验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观看中，生长曲线的测定是最为基本的指标。 原理（选填项目）： 细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。 c、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4、-20） 5. 倒置相差显微镜 6. 培育箱（37、5%co2、饱和湿度） （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头）
2、 2. 培育瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 24培育板 4. 胶塞 （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 （五）试剂 1. d-hanks液 2. 小牛血清 3. rpmi1640 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 0.08%胰酶 （四）、操作步骤 1. 取生长状态良好的细胞，采纳一般传代方法进行消化，制成细胞悬液； 2. 计数，精确地将细胞分别接种于2130个大小全都的培育瓶内或培育孔（以24孔培育板为宜），每瓶或孔细胞总数要求全都，加入培育液的量也要全都。 3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计
3、数，计算均值。培育35d常要给未计数的细胞换液。 4. 以培育时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线 细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有2030%的误差，需结合其它指标进行分析。 2 现在许多试验室利用培育板采纳mtt法进行生长曲线 标准的细胞生长曲线近似“s”形，一般在传代后第一天细胞数有所削减，再经过几天的埋伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最终到达年轻。 4 在生长曲线倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。 二、四唑盐试验（mtt
4、）比色试验 （一）、目的 学习四唑盐比色试验，检测细胞存活和生长状况。 （二）、原理和背景。 四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称mtt。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的mtt还原犯难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此 功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波特长测定其光汲取值，可间接反映细胞数量。在肯定细胞数范围内，mtt结晶物 形成的量与细胞数成正比。 （三）、材料 a、仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4） 5. 倒置相差显微镜 6. co2培育箱 7. 振荡混合仪 8. 酶联免疫检测仪 9. 移液枪
6、效。 （四）、操作步骤 1. 接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培育细胞，用含10%胎牛血清的 rpmi1640培育液配成单个细胞悬液，以每孔103104个细胞接种于96孔培育板中，每孔体积200ul。 2. 培育细胞：将培育板移入co2孵箱中，在37、5% co2及饱和湿度条件下培育。（培育时间取决于试验目的和要求） 3. 呈色：每孔加入mtt溶液（5mg/ml）20ul，37孵箱中连续孵育4h，终止培育，当心吸弃孔内培育上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（1000rpm，5min），然后弃去孔内培育液。每孔加入150ul dmso，振荡10min，使结晶物充分溶解。 4. 比色：选择4
7、90nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光汲取值，记录结果。以时间为横轴，光汲取值为终轴绘制细胞生长曲线。 （五）、留意事项 1 选择适当的细胞接种浓度。在进行mtt试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培育时间。 2 避开血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培育液进行试验。 3 设空白对比，与试验平行设不加细胞只加培育液的空白对比孔。最终比色时，以空白孔调零。 四唑蓝(mtt)法测定细胞生长曲线及生长速度：mtt法绘制3组细胞的生长曲线，分别将细胞用无血清培育液配制成单细胞悬液,计数后接种于96孔板(1104)/孔，设
8、立空白组培育7 d,每天每组细胞各取6孔,每星空体育网站 星空体育首页孔加入mtt溶液0.5 g/l,37连续培育4 h,弃去培育上清液,每孔加入二甲基亚砜(dmso)150 l,振荡使结晶物充分溶解,选择492 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔波长吸光度(a)值的差值,以时间为横轴, a值为纵轴绘制生长曲线: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，（细胞浓度的问题见后面的留意事项）。 2: 5%co2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常
9、在前一天下午铺板，次日上午）加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应线小时，倒置显微镜下观看。 4: 每孔加入10ulmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），连续培育4h。若药物与mtt能够反应，可先离心后弃去培育液，当心用pbs冲2-3遍后，再加入含mtt的培育液。 5: 终止培育，当心吸去孔内培育液。 6: 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值。 7: 同时设置调零孔（培育基、mtt、二甲基亚砜），对比孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培育液、mtt、二甲基亚砜）。 8word版本
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