PCR反应扩增曲线讲解
在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每一个循环变得“可见”,最后通过循环阈值( Cycle threshold,Ct) 和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。
PCR扩增星空体育 星空体育平台过程中,每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。随着反应循环次数的不断增加,所扩增的目的基因片段呈指数规律增长,反应中产生的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正比。仪器实时检测和采集的荧光信号,随着时间和循环数的不断增加,产生一条反映实时荧光信号强度变化的曲线,称为扩增曲线。
1.Ct值:特指在PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号星空体育 星空体育平台达到所设置的阈值时反应所经历的扩增循环次数。起始模板DNA量越多,荧光信号达到阈值的循环数越少,即Ct值越小。反之亦然。
2. 荧光本底信号(baseline):指前15个循环所产生的荧光信号,监测器采集到的真正信号一般指超过阈值的荧光信号。本底信号变化不大,因此接近一条直线个循环所产生的荧光信号的标准差的10倍,一般认为当荧光信号达到这个值时,反应刚刚进入指数期。
4.平台期:PCR扩增时所加的底物、dNTP等是一定的,当反应开始时,反应物充足,扩增得到的产物是持续增加的,但随着底物消耗,就不能继续发生扩增了
