重组载体质粒扩增的实验步骤:Ⅰ、感受态细菌的制备(CaCl2化学转化法)准备:LB液体培养基、LB固体星空体育登录入口 星空体育在线官网平板(含抗生素和未含抗生素)、(预冷)、细菌冻存液(+7%/10%的DMSO或15%的甘油)、高压过的EP管等1、将适合的冻存菌(stbl3)挑取一点(枪头沾取一点)加入盛有1mlLB液体培养基的15ml离心管中;37℃,220rpm,摇菌培养1个小时(复苏)。2、取10μl以下刚复苏的stbl3涂布于非抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养(纯化)。3、挑取20多个前一天培养的细菌菌落加入3mlLB液体培养基里37℃,220rpm,摇菌培养12个小时(扩增,需使细菌老化,因为下一步摇出的菌才可处于对数生长期)。4、以1:100的比例将3ml培养物转接于300mlLB培养基中,在37℃-2小时(使细菌处于对数生长期,易于转化,可每半小时测一下OD600值,-);5、制冰。以下步骤开始注意无菌操作:,在冰上冷却10分钟;℃下3000g冷冻离心10分钟;,,轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,在冰放置20分钟;℃下3000g冷冻离心10分钟;,,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细菌重新悬浮;℃下3000g冷冻离心10分钟;弃去上清,+7%/10%的DMSO或15%的甘油混匀后,分装成100μl或200ul/EP管(4℃预冷),-80℃冷冻贮存备用。【练手实验中扩增摇菌时中途摇床关闭了一段时间(具体不详),后续接着摇菌过夜。离心时用的6000rpm,第二次离心星空体育登录入口 星空体育在线官网时很快溶解,遂进行了第三次离心获取沉淀。配制冻存液忽视了甘油对氯化钙的稀释,%,。分装时每个EP管含有300μl的感受态细菌。】Ⅱ、重组载体质粒转化细菌及转化成功细菌(即转化子)的筛选准备:含筛选抗生素的固体培养基、冰、42℃水浴锅、37℃预热的培养基1、取100μl感受态细菌在冰上解冻,每管加质粒载体(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻弹以混匀内容物,在冰中放置30min。2、将EP管放到预加温到42℃的循环水浴中的浮板上,放置90s~2min,不要摇动EP管。3、快速将EP管转移到冰浴上中,使细菌冷却1~2min4、每离心管加400μlLB培养基,事先用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min至1H使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。5、将适当体积(10μl??)已转化的感受态细菌涂布到含相应抗生素抗性(100μg/ml的终浓度)的LB固体培养基上旋转均匀涂布直至有发涩的感觉,即使平板干燥,然后倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落(或者将质粒涂布均匀后在37℃孵箱里先正放培养30min左右,再倒放培养)。【练手实验中转化VSVG质粒的平板长了2个菌落,。分析原因排除了平板氨苄青霉素浓度(100μg/ml)太高
