牛呼吸道合胞病毒在中国内蒙古地区患牛呼吸道疾病综合征牛群中的分子学调查与病毒载量分析
本研究首次在中国内蒙古地区对出现呼吸道症状的犊牛进行了大规模、系统的牛呼吸道合胞病毒(BRSV)分子流行病学调查，揭示了该地区BRSV的流行特征、季节与地域分布规律，并分析了养殖模式与病毒载量的关联。文章成功开发并验证了一种针对BRSV F与N基因的双靶点多重RT-qPCR检测方法，其检测限可达约5拷贝/μL，具有良好的特异性和重复性。应用该方法对2023年采集的909份临床样本进行分析，发现临床症状犊牛的总体BRSV检出率为21.23%，肺组织样本检出率(35.43%)显著高于鼻拭子样本(17.85%)。研究显示，集约化养殖场的感染风险远高于牧户，且夏季和冬季为检出高峰，中央与西部地区是高风险区域。这些结果为该地区BRSV的监测与防控提供了关键的基础数据和有力的诊断工具。
牛呼吸道合胞病毒（BRSV）是导致牛呼吸道疾病综合征（BRDC）的重要病原体，在全球范围内造成显著的发病率和经济损失。BRSV感染不仅严重影响动物福利和养殖业经济效益，还会显著增加继发性细菌感染的风险。该病毒属于
（Orthopneumovirus），是一种有包膜、非节段、负链RNA病毒。其基因组全长约15kb，编码多种结构蛋白和非结构蛋白，其中融合糖蛋白（F，由574个氨基酸残基组成）和核衣壳蛋白（N，由391个氨基酸残基组成）均高度保守，是分子检测的理想靶点。
然而，目前中国多数BRSV的RT-qPCR检测方法仅针对单一病毒靶基因，当靶基因序列发生变异时，理论上可能存在检测可靠性下降的风险。内蒙古自治区是中国重要的畜牧业基地，牛存栏量位居前列，但针对该地区多样化的养殖模式下BRSV的系统性分子流行病学数据仍然有限。因此，本研究旨在开发一种同时靶向BRSV F和N两个保守基因的双靶点多重RT-qPCR检测方法，以提升检测的稳健性，并应用于2023年内蒙古地区临床样本的检测，全面评估BRSV的流行情况和病毒载量特征，为区域性监测和针对性防控提供方法学基础和流行病学数据。
样本采集于2023年1月至12月，覆盖内蒙古自治区12个盟市，共收集909份临床样本，包括734份鼻拭子和175份肺组织。所有样本均采自有明显呼吸道临床症状（如发热、浆液性至脓性鼻分泌物、持续性干湿咳、呼吸困难）的1至6月龄犊牛。样本采集后立即4℃冷藏，并在72小时内转移至实验室进行处理或-80℃储存。
本研究开发的多重RT-qPCR方法，以BRSV的F基因、N基因以及牛内参基因ABL1为靶点。通过棋盘滴定法优化了引物和探针浓度，最终反应体系包含针对各基因的特异性引物和
建立标准曲线，并评估方法的灵敏度、特异性和重复性。同时，从909份临床样本中分层抽取了200份样本，与已发表的针对F基因和N基因的
所有临床样本均使用建立的多重RT-qPCR方法进行检测。结果判读标准为：无荧光扩增曲线且有扩增曲线判为阳性；Ct值40但有扩增曲线则判为可疑，需重新提取核酸复测。内参基因ABL1无扩增则需重新提取或判为样本无效。F基因或N基因任一阳性即判为样本阳性。
对检测结果进行了系统的流行病学分析，描述了BRSV检出率在地区、季节、生产系统和养殖规模类别间的分布模式，并同时评估了阳性样本中的病毒载量。组间检出率差异使用
优化后的多重RT-qPCR方法表现出优异的分析性能。对于BRSV F基因，标准曲线%；N基因斜率为-3.309，R2=1.000，E=100.5%；内参基因ABL1斜率为-3.290，R2=1.000，E=101.4%。该方法对F、N及ABL1的检测下限均为约5拷贝/μL。特异性试验显示，该方法对
（BPIV-3）等7种常见牛呼吸道病原体均无交叉反应。重复性试验显示，批内和批间变异系数（CV）均低于2.0%，表明方法稳定可靠。与已发表单重方法的比较显示，对于F基因，多重方法与参考方法的总体符合率为98.5%，
（κ）为0.93；对于N基因，总体符合率为97.5%，κ=0.88，表明多重方法在临床样本中保持了与单重方法相当的分析灵敏度。
在909份来自临床症状犊牛的样本中，共检出193份BRSV阳性，总体检出率为21.23%（193/909）。不同样本类型的检出率差异显著：175份肺组织样本中检出62份阳性，阳性率为35.43%（62/175）；734份鼻拭子样本中检出131份阳性，阳性率为17.85%（131/734）。内参基因ABL1在所有样本中均稳定扩增，表明提取效率一致且抑制可忽略不计，支持了检测结果的可靠性。
地域分布分析显示，内蒙古中部和西部地区的BRSV检出率显著高于东部地区。总体阳性率在中部地区最高，为26.44%（87/329），西部为24.17%（95/393），东部仅为6.45%（12/186）。在肺组织样本中，西部和中部地区的阳性率相近且较高（分别为42.37%和42.13%），东部地区显著较低（10.53%）。在鼻拭子样本中，中部和西部地区的阳性率（分别为21.51%和20.96%）也远高于东部（5.37%）。进一步分析各盟市的阳性率，
（2.50%，1/40）的检出率最低。多变量逻辑回归分析证实，在调整季节和农场类型后，东部地区的感染风险显著低于中部地区。
季节性分析显示，BRSV在临床症状犊牛中的检出率呈现明显的季节性波动，夏季和冬季较高，春季和秋季较低。总体阳性率在5月份达到全年最高的50.00%（25/50）。冬季也表现出较高水平，12月份肺组织阳性率高达90.91%（10/11）。相比之下，春季（如3月为13.49%）和秋季（如10月为4.00%）的总体检出率较低。多变量逻辑回归模型显示，与秋季相比，夏季的检出风险最高。各盟市的月度检测模式热图进一步揭示了这种时空异质性，例如
养殖模式分析表明，集约化养殖场的BRSV检出率（30.67%，165/538）显著高于牧户（7.28%，27/371）。在集约化养殖内部，不同规模牧场间的检出率差异无统计学意义，但生产系统（集约化 vs. 牧户）是影响检出率的主要因素。例如，在超大型牧场集群中，肺组织阳性率高达83.33%（10/12）。统计分析确认，集约化农场的感染几率是牧户的5.21倍。
载量5.56，N基因5.67）显著高于鼻拭子样本（F基因4.77，N基因4.57），这与BRSV主要在下呼吸道复制的生物学特性一致。需要强星空体育官方入口 星空体育官网调的是，本研究中鼻拭子和肺组织样本来自不同的动物个体，因此直接比较需谨慎。在地区分布上，东、中、西部三个区域间的病毒载量无显著统计学差异。在季节分布上，病毒载量在春季和夏季显著高于秋季和冬季。养殖模式对病毒载量影响显著，集约化养殖条件下的病毒载量远高于牧户养殖，且在集约化内部，不同规模牧场间的病毒载量也存在显著差异。
本研究成功开发并验证了一种灵敏、特异的BRSV双基因多重RT-qPCR检测方法，并通过引入内参基因ABL1，增强了其在不同样本类型中的可靠性和适用性。应用该方法揭示了内蒙古地区临床症状犊牛中BRSV的流行具有明显的空间异质性、时间聚集性和养殖模式依赖性。中部和西部地区的高检出率可能与较高的牲畜密度、频繁的牛只流动以及生物安全措施实施不足有关。夏季和冬季的双峰流行模式可能与气候和管理因素相关：夏季高温高湿可能导致牛只热应激并削弱黏膜免疫力；冬季严寒导致牛只集中于通风不良的室内，有利于病毒传播。集约化养殖场的高感染风险和高病毒载量，凸显了改善通风条件、优化种群密度管理在BRSV防控中的重要性。
本研究的局限性在于样本来源于临床症状犊牛的便利样本，而非基于概率的普通牛群调查，可能高估了临床病例中的BRSV流行率。此外，本研究未对其他主要BRDC病原体进行同步检测，无法评估BRSV与共感染病原体的相互作用。未来的研究需要结合标准化的多病原体诊断面板，以量化BRSV及其它病原体对临床结局和病毒载量动力学的联合及相对影响。
本研究开发并验证了一种针对BRSV两个基因的多重RT-qPCR检测方法，并将其应用于内蒙古地区出现呼吸道症状犊牛的临床样本检测。结果表明，该方法具有优异的灵敏度、特异性和稳定性，并能提供指示性的病毒载量数据。该检测方法在病例监测方面展现出潜力，揭示了与空间、时间和管理相关的感染模式。研究结果强调，BRSV在内蒙古临床症状犊牛中广泛传播，其流行受多种因素影响，为制定区域性监测和针对性防控策略提供了重要的分子流行病学依据和方法学工具。