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一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法及其试剂盒技术
本发明专利技术提供了一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其中包括如下特征：构建成干扰素γ信号肽和肿瘤细胞结合多肽并链接可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞，高表达新的多肽‑可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性，同时细胞因子诱导杀伤细胞增殖倍数达到1000倍以上，表达CD3+/CD56+为40％以上，CD16+为30％以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；本发明专利技术还提供了一种含通过上述方法而得到的自体细胞因子诱导杀伤细胞增殖培养的试剂盒，具有高效的抗肿瘤功能。
本专利技术涉及一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其中包括如下特征：构建成干扰素γ信号肽(Interferon γ signal peptide，IFNγ-SP)和肿瘤细胞结合多肽(Tumor cells binding peptide，TCBP)并链接可结晶片段域(Fragment crystallizable domain，Fc)重链的第2和3恒定区(second and third constant domain，Ch2and Ch3)基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)，高表达新的多肽-可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；本专利技术还提供了一种含通过上述方法而得到的自体细胞因子诱导杀伤细胞增殖培养的试剂盒，具有高效的抗肿瘤功能。
一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其特征在于，构建成干扰素γ信号肽(IFNγ‑SP)和肿瘤细胞结合多肽(TCBP)并链星空体育登录入口 星空体育在线官网接可结晶片段域(Fc)重链的第2和3恒定区(Ch2 and Ch3)的基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)；其高表达新的多肽‑可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性；激活细胞因子诱导杀伤细胞增殖倍数达到1000倍以上，其表达CD3+/CD56+为40％以上，以及CD16+为30％以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了SP‑(T
1.一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其特征在于，构建成干扰素γ信号肽(IFNγ-SP)和肿瘤细胞结合多肽(TCBP)并链接可结晶片段域(Fc)重链的第2和3恒定区(Ch2 and Ch3)的基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)；其高表达新的多肽-可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性；激活细胞因子诱导杀伤细胞增殖倍数达到1000倍以上，其表达CD3+/CD56+为40％以上，以及CD16+为30％以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了SP-(TCBP)n-L-Fc病毒载体的CIKs其表达SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未转染的CIKs为100倍以上；蛋白印迹技术检测其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表达水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒转染的CIKs培养上清中其灰度高于2000以上。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新的多肽-可结晶片段域重组基因由干扰素γ信号肽、肿瘤细胞结合多肽和可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段构成，干扰素γ信号肽引导融合蛋白导入肿瘤细胞，有助于肿瘤细胞结合多肽结合肿瘤细胞，并锚定可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段在肿瘤细胞胞膜外，与细胞因子诱导杀伤细胞表达CD16分子结合激活抗体依赖性的细胞毒性活性；所述肿瘤细胞结合多肽，优选地，链接两个或两个以上肿瘤细胞结合多肽，可以是同样的或者不同的肿瘤细胞结合多肽；优选，针对前列腺癌肿瘤细胞，所述多肽为与前列腺特异抗原特异结合的多肽；优选，针对乳腺癌肿瘤细胞，所述多肽为与乳腺癌人表皮生长因子受体-2特异结合的多肽；优选，针对肝癌肿瘤细胞，所述多肽为与甲胎蛋白特异结合的多肽；优选，针对肺癌或肠癌肿瘤细胞，所述多肽为与癌胚抗原特异结合的多肽。3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段，优选地，该片段中第24个丝氨酸突变为 天冬氨酸和第117个异亮氨酸突变为谷氨酸，即Fc-D/E，突变的可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段与CD16分子具有更强亲和性；所述细胞因子诱导杀伤细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血或胎盘血的单个核细胞。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，将人IFNγ-SP、多个TCBP和Fc-D/E基因序列通过化学合成获得，在两个TCBP之间以及TCBP和Fc-D/E之间均引入连接多肽，其基因序列为GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFNγ-SP、(TCBP)2和Fc-D/E的cDNA，即SP-(TCBP)n-L-Fc；将SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pUC229载体Hind III/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆的PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合SP-(TCBP)n-L-Fc大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存；将SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体Hind III/BamH I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；取9μg包装混合液和3μg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，混匀，取36μl lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20min；混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养48-72h；根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μl 2E+8TU/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱，即制备成了SP-(TCBP)n-L-Fc慢病毒。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，采集来源于患者自体外周血，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到2-5×106细胞/ml，并补充1000活性单位(IU)/ml IFN-γ和10％自体血清，每20ml加入到75cm2培养瓶中，于37℃、含5％CO2培养箱内培养24h；24小时后加入5-500ng/ml IL-15、5-500ng/ml IL-18，1-500ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(OKT3)和10-2000IU/ml IL-2，于37℃、含5％CO2培养箱内培养2天；第3天补充含5-500ng/ml IL-15、5-500ng/ml IL-18，1-500ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(OKT3)和10-2000IU/ml IL-2和10％自体血清的RPMI 1640培养基，继续培养到第5天；第5天离心收获CIK细胞，并通过苔盼兰计数；第5天以3×106细胞/ml CIK细胞星空体育登录入口 星空体育在线官网加入到六孔培养板，每孔为2ml，于37℃、含5％CO2培养箱内培养过夜；第6天将20μl 1E+7 TU/ml重组SP-(TCBP)n-L-Fc慢病毒加入到人CIK的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37℃、5％CO2的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液RPMI 16404ml，所述完全培养液含10-2000IU/ml IL-2和10％自体血清；当CIK细胞生长密度达到6×106细胞/ml时，转入75cm2培养瓶中生长，6孔对应1个培养瓶，补充完全培养液RPMI 1640到50ml培养体系；于37℃、含5％CO2培养箱内培养到第15-21天，期间根据CIK细胞密度和培养基颜色变化补充含10-2000IU/ml IL-2和10％自体血清新鲜完全培养液RPMI 1640，并扩瓶到175cm2培养瓶中或转移到1.5L培养袋中生长；培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了 SP-(TCBP)n-L-Fc病毒载体的CIKs其表达SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未转染的CIKs为100倍以上；蛋白印迹技术检测其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表达水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒转染的CIKs培养上清中其灰度高于2000以上。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得细胞因子诱导杀伤细胞，增殖倍数达1000倍以上，培养到21天细胞因子诱导杀伤细胞数达3×109...