作为一种常用的活血化瘀中药，在传统中医临床实践中已有数千年的应用历史。《神农本草经》将其列为上品，记载其“主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚；破症除瘕，止烦满，益气”，高度概括了丹参在治疗气血瘀滞相关病症方面的显著功效。随着中医药现代化研究的不断深入，对丹参活血化瘀功效的探索已从传统的经验认知逐步拓展至多学科交叉融合的微观机制研究等。然而，既往的研究都集中在单独或少数几种成分的活性研究，具有确定剂量比例的关键活性成分群如何整体发挥改善血瘀证的功效尚未完全明确。
网络药理学是一种融合信息科学、生物信息学和系统生物学等多学科知识的技术手段，它通过构建药物分子与潜在靶点之间的网络作用关系，系统地揭示药物多靶点、多途径的作用机制[7-8]。这种网络靶点驱动策略不仅为理解药物的整体效应提供了全新研究框架，更成为解析多成分药物复杂作用机制的有力工具。
本课题组前期通过谱效分析筛选出丹参中7种与活血化瘀功效相关的关键活性成分包括丹酚酸类（紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶醛）和丹参酮类（丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮ⅡB），认为是丹参改善血瘀证的关键活性组分群，但是其整体的作用机制尚不清楚。本研究旨在借助网络驱动策略结合动物实验探讨丹参关键活性组分群改善血瘀证的作用机制，为丹参的现代药物制剂研发提供实验依据。
2.1.1获取丹参关键活性组分群及血瘀证的潜在靶点本研究选用多源数据库进行靶点预测与筛选，以确保数据的全面性与可靠性。中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库是中医药系统药理学领域的权威资源，兼具化合物、药动学与靶点信息。将紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶醛、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮ⅡB的英文名称输入TCMSP（）平台获取所选化合物的分子编号（Molecule ID）、分子名称（Molecule name）、药动学参数以及对应靶标数据，并通过UniProt数据库（）对靶标进行规范化统一。选用Swiss Target Prediction数据库（）进行靶点补充，构建丹参活血化瘀功效关键活性组分群靶点信息数据库。
分别在Gene Cards（）、OMIM（）以及TTD（）数据库中，以“Blood stasis syndrome”作为检索关键词，进行血瘀证靶点的查找。Gene Cards数据库的数据导出后首先以相关分数（Relevance score）大于中位数为条件进行筛选，相关分数越高表明靶点与疾病的相关性越强，剔除相关性较弱的靶点，并与另外2个数据库检索到的疾病靶点整合汇总去重，即得到疾病相关靶点，这样有效整合了不同来源和类型的数据，减少了单一数据库的偏倚，为后续网络药理学分析奠定了坚实基础。
2.1.2构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络与筛选核心靶点将丹参关键活性组分群靶点和血瘀证相关靶点整合并导入Venn 2.1.0平台（）进行图谱分析，得到交集靶点，这些靶点将被视为丹参关键活性组分群活血化瘀功效的潜在靶点。将这些潜在靶点上传至STRING（）数据库，种属选定为“Homo sapiens”，置信度设置为最高标准，即≥0.900，同时选择隐藏游离蛋白，其余参数维持默认设定，即得到丹参关键活性组分群活血化瘀功效的潜在靶点的PPI网络图，将数据以tsv格式下载导入Cytoscape 3.7.0软件对PPI网络进行可视化拓扑结构分析，筛选核心靶点。
2.1.3基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析将交叉基因导入DAVID数据库（），进行GO和KEGG富集分析。利用微生信平台绘制GO直方图和KEGG气泡图，进行可视化分析。
2.1.4核心靶点的分子对接模拟验证将7种关键活性组分群与度（degree）值排名前5的核心靶点，采用薛定谔软件，进行分子对接模拟验证，并利用Pymol软件对对接结果进行三维可视化处理。
2.2.1丹参关键活性成分群溶液的配制本课题组前期研究结果显示综合药效指标最好的1批丹参中7种关键活性成分的质量配比为原儿茶醛∶迷迭香酸∶紫草酸∶丹酚酸B∶丹参酮ⅡB∶隐丹参酮∶丹参酮ⅡA＝4∶38∶4∶14∶25∶268∶1。按照以上配比精密称取各化合物适量混合后溶解于2.0 mL 10% DMSO中，制备成质量浓度为1 mg·mL−1的丹参关键活性成分群溶液。
2.2.2大鼠急性血瘀证模型的构建及分组给药本研究主要参考《常用大鼠血瘀证模型的比较研究》[9]进行血瘀证模型的构建，该文献报道肾上腺素构建的血瘀证模型，大鼠血液呈高黏、高浓、高凝状态，对血小板聚集及相关凝血参数的影响也较为显著，适用性较强，常用于各类活血化瘀药物的研究。以0.8 mL·kg−1的剂量对大鼠实施sc盐酸肾上腺素注射液，该注射过程分2次完成，2次注射之间间隔4 h；在首次sc盐酸肾上腺素注射液2 h后，将大鼠浸入冰水中，持续时间设定为5 min；待完成第2次sc盐酸肾上腺素注射液后，大鼠的血瘀证模型即构建完成[9]。
适应性饲养1周后将18只大鼠随机分为对照组（不做任何处理）、模型组、丹参关键活性成分群组，每组6只。模型组：造模后第2天开始连续7 d定时定量每天ig 10% DMSO（20 mg·kg−1，4 mL）1次；丹参关键活性组分群组：造模后第2天开始ig丹参关键活性组分群溶液（20 mg·kg−1，4 mL，6倍人体等效剂量），连续7 d。
2.2.3血清标本的采集对3组大鼠实施禁食不禁水12 h处理后，用3%戊巴比妥钠（30 mg·kg−1），ip麻醉。打开大鼠腹腔，经腹主动脉采集血液。部分血液收集至含有枸橼酸钠抗凝剂的真空采血管内，血液与抗凝剂按9∶1的比例混合，采集后轻轻颠倒采血管，使血液与抗凝剂充分混匀，进行凝血4项[凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）含量]的检查。其余血液标本室温下静置1～2 h，之后放入离心机在4℃条件下，按照3 000 r·min−1的速率离心10 min，将离心后的上层血清使用移液枪吸出，并置于新EP管中，做好标记，放入−80℃冰箱储存备用。
2.2.4心脏标本提取将对照组、模型组、丹参关键活性组分群组大鼠麻醉取血后，扩胸器撑开胸腔暴露心脏，无菌镊钝性分离周边组织后，剪断大血管，将心脏迅速取出分小块，放入冻存管中并编号，迅速投入液氮罐中冷冻，然后转移至−80℃冰箱保存备用。
2.2.5苏木精-伊红（HE）染色取“2.2.4”项下对照组、模型组及关键活性组分群组心脏组织，用梯度乙醇脱水，加二甲苯透明。随后组织块依次在3缸60℃石蜡中浸蜡，包埋后切成4 μm厚切片。切片脱蜡，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各20 min，再经无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、90%、80%、70%乙醇各5 min，最后蒸馏水浸洗5 min。脱蜡切片用Mayer氏苏木素染液染色5 min，自来水洗返蓝；接着用1%水溶性伊红染液染色5 min，自来水洗30 s。随后，切片经70%、80%、90%、95%乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脱水透明2 min，在通风橱中风干。风干后用中性树胶封片，镜检评估心脏组织病理学损伤，并用ImageJ软件分析染色结果。
2.2.6血清生化指标的检测采用双抗体夹心法测定对照组、模型组及关键活性组分群组血清中LDHA、CK-MB、TNF-α以及IL-6的水平。具体操作严格依照试剂说明书，依次历经标准品稀释、加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止、测定11个步骤。完成上述操作后，运用酶标仪在450 nm波长下测量吸光度（A值），并借助标准曲线，最终计算出大鼠血清中LDHA、CK-MB、TNF-α及IL-6的浓度。
2.2.8Western blotting用含有5 mmol·L−1EDTA和2 mmol·L−1PMSF的裂解缓冲液匀浆对照组、模型组及关键活性组分群组心脏组织，然后在10 000 r·min−1转速下离心5 min，分离出总蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，蛋白提取物与5×上样缓冲液按4∶1的比例混合，制备蛋白上样溶液，在100℃下煮沸15 min使其变性。蛋白溶液上样至10% SDS-PAGE凝胶上，电泳完成后转移至PVDF膜上。随后，用相应的一抗溶液在4℃孵育，PVDF膜过夜后用二抗溶液孵育。使用ECL发光液A和B进行条带曝光，并使用Image J软件分析目标条带的光密度。
运用GraphPad Prism 8.0.1统计软件进行数据分析及绘制柱状图，使用单因素ANOVA分析；数据采用表示，P＜0.05为差异有统计学意义。
丹参关键活性组分群经TCMSP和SwissTargetPrediction数据库共同检索，共获得295个靶点。通过Genecard、OMIM、TTD数据库检索整合后共获得血瘀证相关靶点1 258个，将295个成分靶点与1 258个血瘀证靶点导入Venny2.1.0进行作图分析，得到交集靶点67个（图1-A），即为丹参关键活性组分群改善血瘀证的潜在作用靶点。
将丹参关键活性组分、交集靶点和血瘀证靶点信息导入Cytoscape 3.7.0软件，绘制“成分-靶点-疾病”网络图（图1-B），共获得75个节点（包括67个靶点、1种疾病和7种活性成分），181条边，其中蓝色代表交集靶点，绿色代表活性成分，红色代表血瘀证，运用“Network analysiser”工具拓扑分析后，设置形状大小随degree值而变化。7种化合物按degree值排序为丹参酮ⅡA＞隐丹参酮＞迷迭香酸＞丹参酮IIB＞紫草酸＞丹酚酸B＞原儿茶醛，degree值较高的节点通常被认为具有更重要的生物学功能或在网络中发挥更关键的作用，意味着该化合物有潜力通过多种途径对疾病产生影响。
将67个潜在作用靶点导入STRING数据库，构建PPI网络，将其数据处理后导入Cytoscape3.7.0软件，网络拓扑分析显示59个节点，238条边（图1-C）。节点代表蛋白，连线体现蛋白功能相关性，节点颜色越深、尺寸越大，其degree值越高。按照degree值排名，排名前10的靶点为原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、信号转导与转录激活因子3（STAT3）、肿瘤蛋白p53（TP53）、TNF、表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、B细胞淋巴瘤2蛋白（BCL2）、原癌基因c-Myc（MYC）、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2（ERBB2）和前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）。
GO功能分析共得到P＜0.05的264个富集结果，依据每条目的基因数目进行降序排列，按照P＜0.05的标准，分别取每类条目的前10条，数据整合后通过微生信平台绘制富集柱状图，见图2-A。其中生物过程（BP）141项，主要涉及信号转导、RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控、染色质重塑等。细胞组分（CC）35项，主要涉及质膜、细胞质、细胞溶胶等。分子功能（MF）88项，主要涉及蛋白结合、相同的蛋白结合、金属离子结合等。这些过程共同反映了血瘀状态下细胞应激、炎症反应与基因表达调控的紊乱，表明血瘀证的发生与细胞膜结构、胞内物质运输、代谢场所的功能异常、蛋白质互作和离子结合等密切相关。
根据KEGG富集结果，得到了107条信号通路，主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、癌症中的蛋白聚糖、脂质和动脉粥样硬化通路等。根据计数（每条通路的基因数），选出前10条信号通路绘制气泡图，见图2-B。PI3K-Akt信号通路在图中纵坐标最上方，说明它和丹参治疗血瘀证的关联性最强，丹参可能通过调节该通路中关键分子（如Akt、PI3K亚型等）改善血瘀状态下的血管功能与细胞代谢。Proteoglycans in cancer信号通路排在第2位，Proteoglycans（蛋白聚糖）在心血管系统中参与细胞外基质重塑、炎症响应与血管通透性调控，丹参或通过干预蛋白聚糖合成/降解通路，调节血管外基质环境与炎症因子释放以改善血行。以上通路从分子层面揭示了血瘀证的多通路、多靶点调控特点，为阐释血瘀证的现代生物学内涵及丹参关键活性组分群的干预机制提供了重要依据。
丹参关键活性组分与排名前5的核心靶点（SRC、STAT3、TP53、TNF、EGFR）进行对接，解析关键活性组分群能否通过以上关键靶点发挥活血化瘀的功效。根据不同成分与各靶点的对接得分和MMGBSA结合自由能（表2和图3），7种成分与5种靶点之间均呈现出一定的结合能力。一般配体星空体育登录入口 星空体育在线官网与受体结合能越低，代表对接的构象越稳定。
由图4可知，与对照组对比，盐酸肾上腺素诱导的大鼠急性血瘀证模型PT、TT、APTT显著缩短（P＜0.05），FIB含量显著升高（P＜0.05），大鼠血液呈现高凝状态，内、外源性凝血途径活性增强，纤维蛋白原含量增加，符合血瘀证血液流变学特征，表明大鼠急性血瘀证模型构建成功。丹参关键活性组分群干预后，对急性血瘀证大鼠模型凝血4项指标均有改善作用，差异有统计学意义（P＜0.05）。
如图5所示，在HE染色下，对照组的心壁和心腔无明显异常，心肌纤维颜色均匀，细胞分界清晰，间质无异常，并且没有观察到明显的坏死或炎症细胞浸润；在模型组中，大面积心外膜可见结缔组织增生，伴有更多的淋巴细胞浸润，心肌细胞排列不规则，可见心肌细胞坏死；丹参关键活性组分群干预后，血瘀证大鼠的淋巴细胞炎症浸润和心肌细胞坏死减少，心肌纤维得到修复。
如图6所示，与对照组相比，模型组血清中TNF-α、IL-6、CK-MB和LDHA水平显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，丹参关键活性成分群组血清中TNF-α、IL-6、CK-MB和LDHA水平明显下降（P＜0.01、0.001）。
本研究采用qRT-PCR检测对照组、模型组和丹参关键活性组分群组心脏组织中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的mRNA表达，结果如图7所示。与对照组相比，模型组PI3K、Akt和Bcl-2的相对mRNA表达水平明显降低（P＜0.05），Caspase-3的相对mRNA表达水平明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，丹参关键活性组分组PI3K、Akt和Bcl-2的相对mRNA表达水平明显升高（P＜0.001），Caspase-3的相对mRNA表达水平明显降低（P＜0.001），Caspase-3基因表达受到负调控，可能会导致体内Caspase-3蛋白水平下降。
3.8丹参关键活性组分群在蛋白表达层次干预PI3K/Akt信号通路改善血瘀证
通过Western blotting检测对照组、模型组和丹参关键活性组分群组大鼠心脏组织中PI3K/Akt信号通路相关蛋白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2和Caspase-3的表达水平，结果如图8和图9所示。与对照组相比，模型组Caspase-3蛋白水平明显升高，Bcl-2、p-Akt、p-PI3K和PI3K蛋白水平明显降低（P＜0.05），而Akt蛋白水平无差异（P＞0.05）。与模型组相比，治疗组Caspase-3蛋白水平明显降低，Bcl-2、p-Akt和p-PI3K蛋白水平明显升高（P＜0.05），而Akt和PI3K蛋白水平无明显差异（P＞0.05）。这些结果表明，丹参关键活性组分群可通过下调Caspase-3蛋白水平，上调Bcl-2、p-Akt和p-PI3K蛋白水平来调节PI3K/Akt信号通路，这可能是丹参关键活性组分群通过抑制心肌细胞凋亡发挥活血化瘀功效改善血瘀证的作用机制。