CTLA4Ig基因修饰的BMSCs支持CD34 细胞扩增的实验研究pdf
［文章编号］1000-8861（2003）02-0121-06 基因修饰的支持 第三军医大学附属西南医院肿瘤血液科，重庆400038；2. 第三军医大学附属西南医院全军烧伤研究所， 重庆400038） ［收稿日期］2002 04；［修回日期］2002 28［作者简介］王吉刚（1974 ），男，云南曲靖市人，博士生，主要从事造血干细胞移植方面的研究。TeI：（023）65392577； E-maiI：Ynjg-w@Chinaren. com 目的通过腺病毒介导 CTLA4g 在骨髓基质细胞（BMSCs）中的表达，探讨 CTLA4g 基因修饰的 BMSCs 支持 CD34 细胞扩增的功能变化，为该基因修饰的BMSCs联合造血干细胞移植（HSCT），达到预防移植物抗宿主病（GVHD）和纠正预 处理损伤的造血微环境（HM）积累实验依据。方法 infection，MO）50转染 BMSCs，以RT-PCR 检测目的基因转录；免疫磁珠（MACS）阳性选择分选骨髓CD34 细胞，流式细胞仪检测其纯度；通过骨髓基质细胞支持CD34 扩增的细胞总数及集落形成细胞数（CFC）的变化，比较转染和未转染BMSCs 在支持 CD34 细胞扩增方面的差异。结果 RT-PCR 在转染组及转染后传两代BMSCs 中检测到 CTLA4g 基因的转录；通过观察扩增后细胞总数及 CFC 化，发现CTLA4g基因转染组与未转染组BMSCs 支持CD34 05）。结论CTLA4g-重组腺 病毒有效介导目的基因对BMSCs 的转染，在MO 为50 时对其支持造血的功能无显著影响。 ［关键词］ CTLA-4；骨髓基质细胞；移植物抗宿主病；腺病毒载体；免疫耐受；共刺激信号 ［中图分类号］ R331. 2，R392. WANGJi-gang ，LANGHou-jie ，SHXi-kai ，CHENJie-ping ，LUOGao-xing functionchange CTLA4g-modifiedbone marrow stromaI ceIIs （BMSCs）mediated adenovirusvector offersome data preventgraft-versus-host disease（GVHD）and ameIiorate hematopoieticinductive microenvironment （HM）resuIted from fore-disposaI transfectedBMSCs （MO 50）wasconfirmed RT-PCR.We compared supportingCD34 ceIIsseIected proIiferatethrough coIonyforming ceII（CFC）. RT-PCRcan detect transfectedgroup passagenumber two. supportCD34 proIiferatewere significantIydifferent（ Ad-CTLA4gcouId transfect BMSCs efficientIy. Transfection mediated Ad-CTLA4gwhen MO 50hadn’t affected BMSCs’adhesionfunction supporthematopoiesis. CTLA-4；Bonemarrow stromaI ceIIs；Graft-versus-host disease；Adenovirus vector；mmune toIerance；Co-stimuIation signaI 移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease， GVHD）是异基因骨髓移植（AIIogeneic bone marrow transpIantation，aIIo-BMT）的主要并发症和造成死亡 的一个重要原因 。传统的防治方法是以破坏机体免疫机能或牺牲移植物抗白血病（Graft-versus-Ieuke- mia，GVL）作用为代价的。研究发现，成熟 细胞在GVHD 的发生与发展中起着核心作用 细胞活化必须同时存在 MHC/抗原肽-TCR 和共刺激信 号，也当缺少或阻断T 细胞的共刺激信号，将导致 细胞的无反应（Anergy）、细胞凋亡（Apoptosis）或克隆丢失（CIone depIetion）等的发生，从而诱导免疫耐受 （mmune toIerance）。研究证实，在众多的共刺激信 号途径中，作用最明显、最肯定的是 B7/CD28 细胞共刺激途径，诱导特异性免疫耐受成为 GVHD 防治的新思路 MMUNOLOGCALJOURNAL VoI Mar.2003 ，）是支持和调节造血细胞定居、增殖、分化、发育和成熟的内环境。另外，预处 理导致的造血微环境（ 造血损伤和免疫功能降低，甚至移植失败的重要原因之一。 体外易培养和扩增，在体内是个相对静止、更新率低的群体，外源基因的表达可以持续较长的时间，并且 其代谢活力很高，有利于重组蛋白的分泌，所以成为 基因治疗理想的靶细胞。近年来，国外提出“基质细 胞基因治疗（ ）”的概念。为此，本研究以探讨 重组腺病毒转染 的可行性及其转染对其功能的影响为目的。 为该基因修饰的 骨髓来源骨髓取自健康志愿者，骨髓穿刺术 星空体育登录入口 星空体育在线官网抽取 ，以肝素抗凝（ 重组腺病毒载体由全军烧伤研究所构建 细胞培养基（公司）， 胎牛血清（ 公司），马血清（北京邦定生物公 司），人淋巴细胞分离液（天津血液学研究所）， 显色试剂盒（武汉博士德公司），胰蛋白酶、巯基乙 醇、甲基纤维素（ 公司），小鼠抗人 细胞分选试剂盒（ 均为公司产品 引物设计合成根据基因库中人 基因序列，设计如下 ’。引物由上海生物工程公司合成。 培养液充分混合，淋巴细胞分离液分离单个核细胞（ ，），洗涤 后制成细胞悬液并计数，将 接种于如下培养体系：培养液，内含 的胰蛋白酶消化基质细胞，并扩瓶培养。直至进入对数生长期，可以规则传代。 取生长状态良好的 ，以抑制基质细胞滋养层继续生长，但不影响其分泌造血生长因子。消化后制成细胞悬液， 计数，并调节细胞数至 孔板，转染组与非转染组各设孔，用于 支持 用于转染，瓶用于对照。以上各组 加入重组腺病毒，轻轻摇晃使载体液均匀散布 于所有细胞。将细胞置于细胞培养箱中培养，每 轻轻摇晃次，使载体液均匀接触所有细胞。 后吸出重组腺病毒，并用培养液洗涤细 细胞培养液继续培养。转染后 瓶转染细胞继续培养，达融合后传代（接种密度为 ）继续培养，传代细胞达融合后，留取培养上清液，提取总 再传代次并提取总 细胞的分选分离骨髓 进行磁标记，洗脱阴性细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱
转白血病抑制因子基因人胚肺成纤维细胞对脐血CD34~+细胞体外扩增的影响
CD34~+造血干祖细胞在转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞中的扩增及其移植SCID小鼠的实验研究
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CTLA4Ig基因修饰的BMSCs支持CD34^+4细胞扩增的实验研究
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Tpo、IL-11基因修饰的基质细胞对CD34^+CD38^-早期造血祖细胞扩增的影响
转染 hox b4基因的人脐带间充质干细胞体外扩增人脐血cd34细胞的对策
转hf l、 hgmcsf基因人骨髓基质细胞对脐血cd34细胞体外扩增作用的对策
Wnt3a基因对脐血来源CD34 造血干祖细胞体外扩增及定向分化作用的研究
转FL、GM-CSF基因的人骨髓基质细胞促进脐血CD34^+细胞体外扩增