本发明提供了一种单细胞的全基因组的扩增方法及试剂盒，其包括分离提取出单个细胞；提取单个细胞的全基因组DNA；用稀释溶液稀释全基因组DNA，得到DNA模板，将DNA模板与随机引物octamer混合得到混合液A，将10×Phi29Buffer、dNTPs、dUTP、Phi29Polymerase和水混合得到混合液B，然后将混合液A与混合液B等体积加入反应管混合形成反应液并加入矿物油覆盖反应液进行多重置换扩增反应；并且对扩增产物进行纯化获得纯化DNA。
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 112359097 A (43)申请公布日 2021.02.12 (21)申请号 9.8 (22)申请日 2014.11.28 (62)分案原申请数据 6.5 2014.11.28 (71)申请人 深圳市海普洛斯生物科技有限公司 地址 518000 广东省深圳市高新技术产业 园北区松坪山路3号奥特迅电力大厦8 楼 (72)发明人 许明炎 (74)专利代理机构 深圳舍穆专利代理事务所 (特殊普通合伙) 44398 代理人 黄贤炬 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844 (2018.01) 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (54)发明名称 单细胞的全基因组的扩增方法及试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种单细胞的全基因组的扩 增方法及试剂盒，其包括分离提取出单个细胞； 提取单个细胞的全基因组DNA；用稀释溶液稀释 全基因组DNA，得到DNA模板，将DNA模板与随机引 物octamer混合得到混合液A，将10 ×Phi29 Buffer、dNTPs、dUTP、Phi29 Polymerase和水混 合得到混合液B，然后将混合液A与混合液B等体 积加入反应管混合形成反应液并加入矿物油覆 盖反应液进行多重置换扩增反应；并且对扩增产 物进行纯化获得纯化DNA。 A 7 9 0 9 5 3 2 1 1 N C CN 112359097 A 权利要求书 1/1页 1.一种单细胞的全基因组的扩增方法，是能够进行单个细胞的全基因的扩增以提供足 量的DNA作为检测使用的扩增方法，其特征在于，包括：分离提取出单个细胞，所述单个细胞 为肿瘤细胞；提取所述单个细胞的全基因组DNA；用稀释溶液稀释所述全基因组DNA，得到 DNA模板，将所述DNA模板与随机引物octamer混合得到混合液A，将10×Phi29 Buffer、 dNTPs、dUTP、Phi29 Polymerase和水混合得到混合液B，然后将所述混合液A与所述混合液B 等体积加入反应管混合形成反应液并加入矿物油覆盖反应液进行多重置换扩增反应，从而 获得扩增产物，在反应液中，所述随机引物octamer的浓度为20μM，dNTPs的浓度为0.5mM， dUTP的浓度为0.05mM，Phi29 Polymerase的浓度为5U/μL，所述多重置换扩增反应的条件为 在30℃下反应4-10个小时，在所述多重置换扩增反应完成后，反应液升温至65℃失活酶，随 后向所述反应管加入50μL水，混合均匀并快速离心，将反应液转移至封口膜，使所述矿物油 分散到所述封口膜，然后将反应液吸取到小试管中，接着使用Qubit 2.0 fluorometer测试 获得所述扩增产物的DNA浓度；并且对所述扩增产物进行纯化获得纯化DNA。 2.如权利要求1所述的扩增方法，其特征在于， 纯化DNA的方法选用Backman的Agencourt AMPure XP试剂盒或Qiagen Mini PCR column。 3.如权利要求1所述的扩增方法，其特征在于， 提取所述单个细胞的全基因组DNA的方法为Cell Search方法或微流控芯片提取法。 4.如权利要求1所述的扩增方法，其特征在于， 提取所述单个细胞的全基因组DNA的方法包括以下步骤：通过向所述单个细胞加入细 胞裂解酶和裂解液，静置10分钟，并通过裂解细胞得到全基因组DNA。 5.如权利要求1所述的扩增方法，其特征在于， 还对所述纯化DNA进行测序分析，在所述测序分析中，测序覆盖率高于95％，测序错误 -7 -6 率为1×10 至1×10 。 6.如权利要求1所述的扩增方法，其特征在于， 所述DNA浓度为300至3000ng。 7.一种单细胞的全基因组的扩增试剂盒，其特征在于， 使用权利要求1至6中的任一种所述的扩增方法。 2 2 CN 112359097 A 说明书 1/4页 单细胞的全基因组的扩增方法及试剂盒 [0001] 本申请是申请日为2014年11月28日、申请号为6.5、发明名称为一种 基于MDA的全基因组扩增的方法的专利申请的分案申请。 技术领域 [0002] 本发明涉及DNA扩增技术领域，具体地，涉及一种单细胞的全基因组的扩增方法及 试剂盒。 背景技术 [0003] 过去二十几年里，随着基因测序技术水平的提高以及千人基因组计划、癌症基因 组计划、Meta-Hit计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向高潮。然 而，迄今为止使用的测序材料无一例外都是数百万甚至更多细胞的混合DNA样本。这种方法 能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均 值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。例如，科学家想 找出哪种突变存在于哪种细胞中几乎是不可能的，只存在于少数细胞(如早期癌细胞)中的 突变也基本上被掩藏。另一方面，有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不足以进行全基 因组分析，例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等。这些都是全基因组测 序遇到的难题。 [0004] 单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新 技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基 因组之后通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。 [0005] 全基因组扩增技术主要分为两种类型：一是基于热循环以PCR为基础的扩增技术， 如简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、连接反应介导的PCR(LM-PCR)、扩增前引物延伸反应 (PEP)等；一是基于等温反应不以PCR为基础的扩增技术，如多重置换扩增(MDA)和基于引物 酶的全基因组扩增(pWGA)。 [0006] 在这两种类型中，PCR扩增比较经典，但是，对不同的序列来说，PCR扩增的效率存 在相当大的偏差，易产生扩增偏倚问题：如富含CG的DNA序列和相应基因座位的非随机丢 失，等位基因的非随机丢失，以及与DNA片段大小相关的偏差(倾向于扩增更多短片段)，尤 其是在应用于单细胞时，大量短片段导致片段间序列丢失，从而使其应用受限 [0007] MDA是目前公认的最好的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进行高保线kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列。但当样本 量降低到单个细胞，就无法得到准确的扩增，对于单细胞基因组扩增需求来说，目前存在技 术壁垒。MALBAC的方法存在操作复杂，覆盖率不高，PCR引入误差等等缺陷。对于临床应用， 存在这一些包括流程复杂、覆盖率不高、误差等问题。 发明内容 [0008] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种基于MDA的全基因组扩增的方法，该 3 3 CN 112359097 A 说明书 2/4页 方法能够有效的进行单个细胞全基因组的扩增，提供足够量的DNA为后续检测使用。该方法 克服了覆盖率低的问题，相比PCR的方法，该方法降低了误差率，操作简便，更便于临床检测 采用。 [0009] 本发明的技术方案如下：一种基于MDA的全基因组扩增的方法，其特征在于，包括 如下步骤， [0010] 1)分离提取出单个细胞； [0011] 2)提取所述单细胞的基因组DNA；单细胞基因组DNA的提取目前有很多种方法，比 如Cell Search的方法，微流控芯片提取法。本发明获得单细胞基因组DNA的方法还可以是 加入细胞裂解酶和裂解液，静置10分钟，通过裂解细胞得到其基因组DNA； [0012] 3)以步骤2)所得单细胞基因组DNA用稀释溶液稀释，得到DNA模板，用Haplox法单 细胞全基因组扩增试剂盒进行多重置换扩增 [0013] 4)将步骤3)所得产物进行纯化，得到纯化DNA。 [0014] 还包括步骤5)测序分析所得纯化DNA。 [0015] Haplox法单细胞全基因组扩增试剂盒进行多重置换扩增的具体步骤如下： [0016] 制备混合液A：在扩增体系中，加入随机引物octamer和DNA模板，随机引物octamer 的浓度为40μM，得到混合液A； [0017] 制备混合液B：新鲜混合10x Phi29 Buffer,1mM dNTPs,0.1mM dUTP,H2O,and Phi29 Polymerase(10U/μL,Enzymatics)，得到混合液B；4℃保存备用； [0018] 反应进行：将混合液A与混合液B等体积混合加入反应管，在30℃下反应4-10个小 时，升温至65℃失活酶； [0019] 测试DNA浓度：随后向反应管加入50uL H O，用Qubit 2.0fluorometer测试DNA的 2 浓度至300－3000ng DNA。 [0020] 较佳地，反应进行时，将混合液A与混合液B等体积混合加入反应管后，再加入矿物 油覆盖反应液，而后在30℃下反应。 [0021] 较佳地，反应完成后，升温至65℃失活酶，随后向反应管加入50uL H2O，混合均匀， 快速离心，将混合液转移至干净无菌的封口膜上，液相会呈现水珠液滴，油相会分散到封口 膜上；用移液枪将液滴吸取到一个新的无菌小试管中，用Qubit 2.0fluorometer测试DNA的 浓度至300－3000ng DNA。 [0022] 纯化DNA的方法选用Backman的Agencourt AMPure XP试剂盒或Qiagen Mini PCR column。 [0023] 本发明的有益效果为：本发明所述基于MDA的全基因组扩增的方法，该方法能够有 效的进行单个细胞全基因组的扩增，提供足够量的DNA为后续检测使用。而且该方法克服了 覆盖率低的问题，相比PCR的方法，该方法降低了误差率。该方法操作简便，更便于临床检测 采用。 附图说明 [0024] 图1为MDA法扩增，MALBAC法扩增和普通PCR扩增的测序覆盖率比较结果。 [0025] 图2为MDA法扩增，MALBAC法扩增和普通PCR扩增的测序错误率比较结果。 4 4 CN 112359097 A 说明书 3/4页 具体实施方式 [0026] 除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通 常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而不应理 解为对本发明的限制。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明进行改动得到的技 术方案都将落入本发明的权利要求范围之内。 [0027] 实施例 [0028] 在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、为生物学、重组DNA 和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的常规技术。这些技术在下了 文件中有详细描述：Sambrook等人编著的Molecular Cloning:Alaboratory Mannual,第二 版(1989)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgin编著，1984)； Immnochemical Methods in Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)。 [0029] 实施例1： [0030] 一种基于MDA的全基因组扩增的方法，包括如下步骤， [0031] 1)分离提取出单个肿瘤细胞； [0032] 2)用Cell Search的方法提取所述单个肿瘤细胞的基因组DNA； [0033] 3)以步骤2)所得单细胞基因组DNA为模板，分别用Haplox法单细胞全基因组扩增 试剂盒进行多重置换扩增(MDA)，具体地，包括如下步骤： [0034] 制备混合液A：在扩增体系中，加入随机引物octamer和基因组DNA模板，随机引物 octamer的浓度为40μM，得到混合液A； [0035] 制备混合液B：新鲜混合10x Phi29 Buffer,1mM dNTPs,0.1mM dUTP,H2O,and Phi29 Polymerase(10U/μL,Enzymatics)，得到混合液B；4℃保存备用； [0036] 反应进行：将混合液A与混合液B等体积混合加入反应管，再加入矿物油覆盖反应 液，在30℃下反应4-10个小时，升温至65℃失活酶； [0037] 测试DNA浓度：随后向反应管加入50uL H O，混合均匀，快速离心，将混合液转移至 2 干净无菌的封口膜上，液相会呈现水珠液滴，油相会分散到封口膜上；用移液枪将液滴吸取 到一个新的无菌小试管中，用Qubit 2.0fluorometer测试DNA的浓度至300－3000ng DNA。 [0038] 4)将步骤3)所得产物分别进行纯化，得到纯化DNA； [0039] 5)分别测序分析所得纯化DNA，将测序结果与星空体育官方入口 星空体育官网模板DNA序列进行对比，计算测序覆 盖率和错误率，将数据记录如表1，并依据表1中的数据作图1和图2。 [0040] 表1.Haplox法单细胞全基因组扩增覆盖率和错误率比较 [0041] [0042] 比较测序结果表明，用Haplox法单细胞全基因组扩增试剂盒进行多重置换扩增 (MDA)，测序覆盖率高于95％，而MALBAC法扩增的测序覆盖率90-93％，普通PCR扩增的分别 为测序覆盖率不高于85％。 [0043] 比较测序结果表明，用Haplox法单细胞全基因组扩增试剂盒进行多重置换扩增 -6 -4 (MDA)，测序错误率为1X10 ，而MALBAC法扩增和普通PCR扩增的测序错误率为1X10 和1x10 -5 。 5 5 CN 112359097 A 说明书 4/4页 [0044] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干 简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。 6 6 CN 112359097 A 说明书附图 1/1页 图1 图2 7 7
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