背景简介：hESC(H1)细胞株来源于健康男性内细胞团，贴壁生长，呈克隆状，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。
本项目的实验目的是培养人胚胎干细胞（ESC H1）并通过电镜观察，荧光免疫法，流式细胞法来进行鉴定，以上结果显示，本公司培养人胚胎干细胞（ESC H1）鉴定正确，可供科研使用。
2. 参考表1在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC完全培养基，之后置于4℃储存，封口膜封好后2周内使用。
3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置100 mL，保证2周内使用完毕。
2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人；1mL无菌吸头；EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。
3. 将Matrigel放置4℃冰箱过夜解冻，当Matrigel完全解冻即可开始分装。
注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。
4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。
5. 混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。
2. 1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel（5mL）置于4℃冰箱解冻至完全化冻。
3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。
5. 吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。
1. 将水浴锅预热至37℃；并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（15~30℃）。
3. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。
4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。
注：可留20 μL上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。
6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，将细胞悬液按照2 mL/孔接种到1个孔中。
7. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。
8. 18-24小时后换新的hESC/iPSC完全培养基，之后每天更换培养基。
注：在hESC(H1)培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。
① 细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示），一般情况下每3-4天传代；
可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀（如图1(C-D)所示），建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。
3. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。
5. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。
7. 将孔内培养基吸取，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸取。
注：① 消化8-9 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；
图1. hESC/iPSC完全培养基连续培养hiPSC细胞形态图：（A）和（C）分别为hESC(H1)细胞培养第2和4天时低倍镜hESC(H1)培养形态图示，（B）和（D）为培养至第2和4天时的高倍镜hESC(H1)培养形态图。
10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。
注：① 加hESC/iPSC完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（ 10min）。
图2：消化hESC(H1)细胞不同时间形态图：（A）消化8 min低倍镜hESC(H1)培养的的形态图;（B）消化9 min低倍镜hESC(H1)培养的的形态图。
②hESC(H1)细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过4孔（六孔板）。
13. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液星空体育官方入口 星空体育官网轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。
注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤9获得的细胞悬液收集至2mL离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次；再按照传代比例接种。
14. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。
15. 18-24小时后更换新hESC/iPSC完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。
1. 当细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示）可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。
2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。
4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃数次，再吸取。
8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，干冰运输的细胞检查干冰是否完全挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2.仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。
4. 建议客户复苏细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。