细胞培养，看似简单的一个实验，却不知道难倒了多少科研朋友们~今天小编就为大家详细普及细胞培养，传代、冻存以及复苏的步骤和注意事项，预祝广大科研朋友们顺利完成实验哦！
泡酸过夜，洗涤干净之后用单蒸水清洗一遍，然后在75℃烘箱过夜烘干，在管尾塞入脱脂棉放入不锈钢灭菌筒灭菌（120℃，30min），不锈钢灭菌筒贴上灭菌标签，灭菌完成后烘干备用。（高压灭菌条件一致120℃,30min；烘干条件一致为在75℃烘箱过夜）；
配制好的PBS（pH=7.4），用0.45μm滤膜过滤，高压灭菌，注意液体试剂在封闭容器中灭菌时将容器盖拧松，待灭菌完成后再旋紧，放入冰箱4℃备用；
一般细胞培养都用10%体积浓度的胎牛血清的RIMP-1640或DMEM培养基，加入双抗（青霉素、链霉素C0222，碧云天），配制时在超净台里操作，配制好以后放入4℃备用；
1、将所需耗材如移液器、离心管架、移液管、Tip、培养器皿等经酒精消毒（喷雾）后放入超净台，紫外照射30min。
2、培养基、PBS、胰酶消化液等试剂先温浴到37℃，经酒精消毒（喷雾）后放入到超净台。
1)分离取得的原代细胞用PBS洗涤，1000rpm 离心5min，洗涤两次，然后加入适量培养基，37℃，5% CO₂孵箱培养。
2) 原代细胞培养所需的耗材如培养瓶、离心管（NUNC）最好使用一次性的。
1) 贴壁细胞培养传代：贴壁细胞先弃去旧培养基，在消化前先用PBS在培养器皿中洗涤1次，尽量弃去PBS后加入适量胰酶消化液（通常1-3 ml即可）。左右晃动培养皿/瓶使胰酶覆盖流过整个培养面后，放入孵箱2-5分钟，期间注意观察。在显微镜下观察细胞收缩后，加入新培养基终止消化。可轻微拍打培养瓶，加速细胞脱落。
2) 悬浮细胞培养传代：移液管吹打细胞收集到离心管中，若是悬浮细胞吹打重悬后移入离心管（无胰酶消化步骤），1000rpm 室温离心5min，弃去上清，加入适量培养基重悬，细胞计数后吸取所需细胞到培养器皿，补加培养基，37℃，5% CO₂孵箱培养。
需冻存的细胞经过传代步骤后，重悬于冻存液，转移到冻存管（通常1mL/管，不少于2*10^6细胞），放入冻存盒保存-80℃冰箱，过夜后移入液氮。
一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水浴中，使之迅速融解。等到冻存管中仅存一小片冰时，迅速将细胞转移到含9ml冷的培养基中（先将之置于15ml离心管中，放于冰上）。1000rpm 室温离心5min，弃去上清，加入适量培养基重悬后将细胞转入培养器皿中进行培养。
2、细胞培养的关键点在于星空体育网站 星空体育首页细胞培养的密度，传代时细胞密度不能过低，否则影响细胞间信号传递，最终会导致细胞状态不好；细胞培养到一定密度时，需要传代，一般贴壁细胞看细胞融合到80%就可传代，而培养悬浮细胞时，可通过看培养基颜色以及细胞密度来判断是否传代。
3、在培养传代过程中，需要用移液管吹打处理细胞，此时应尽量避免气泡的产生，否则产生的剪切力会对细胞有损伤，最终影响细胞状态。（吹打过程中可以残留部分液体在移液管内，以减少气泡的产生）
4、细胞洗涤离星空体育网站 星空体育首页心的时候，离心力的选择一般是：原代细胞离心300-500g/5min，肿瘤细胞200-300g/5min。离心力过小收集到的细胞数量不够，离心力过大对细胞有损伤。
5、离心后的细胞沉淀弃去上清后，先弹散细胞沉淀，后加入培养基重悬铺板，这样比直接吹打细胞沉淀对细胞损伤小，提高传代后细胞活率。
6、细胞培养基应先在37℃温浴后使用，可以分装每次需要的量来温浴，避免反复温浴对培养基性能的影响（特别是含有蛋白或者细胞因子的培养基）。
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