[0001] 本申请是2007年3月22日提交的题为细胞扩增方法和藉此产生的细胞和条件 培养基用于治疗的用途的中国专利申请1. 7的分案申请。
[0003] 本发明设及细胞扩增方法、藉此产生的细胞群及其用途。具体地本发明设及扩增 来自胎盘或脂肪组织（贯穿于整个PCT中）的粘附细胞（a化erentcell)的方法及其例如 用于造血干细胞移植的治疗用途。
[0004] 在日益发展的医学界，为了细胞植入和组织工程目的越来越需要大量成人干细 胞。另外，成人干细胞疗法正持续不断地开发用于治疗和治愈各种病症，例如造血功能障 碍、屯、脏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、烧伤、肌肉萎缩症、自身免疫病、糖尿病和 关节炎。
[0005] 造血干细胞化SC)是祖细胞，其产生髓系和淋己系的所有血细胞类型。移植的服C 的植入和启动造血作用取决于HSC在受者骨髓中的归巢和增生的能力。
[0006] 普遍公认干细胞在体内与骨髓中离散的食（niche)有密切的联系，所述食提供了 经由细胞间接触或短距离作用共同介导干细胞分化和自我更新的分子信号。运些食是造 血诱导性微环境(HIM)的部分，由骨髓细胞即巨隧细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和内皮细胞 组成。骨髓细胞通过提供促进细胞间接触的细胞外基质巧CM)蛋白和基底膜组分来保持 HIM功能完整性。它们还提供用于控制造血细胞分化和增殖所需的各种可溶性或常驻性细 胞因子。
[0007] 需要HSC和基质之间的相互作用W保护HSC生存力并防止其分化。在HSC移植 后，移植的HSC在其增殖和分化之前必须归巢到骨髓度M)微环境并驻留在合适食中。在归 巢过程中，移植的HSC离开血流，并通过随趋化因子梯度穿过BM内皮细胞屏障到达专用食 来转移。然后供者HSC必须归巢到造血食，在那里它们遇到对其分裂更有利的微环境，在那 里HSC与间充质细胞、ECM和分泌的生长因子之间可建立连续统一的物理和化学接触。所 有运些过程设及一系列复杂的分子，例如细胞因子、趋化因子、激素、类固醇、细胞外基质星空体育登录入口 星空体育在线官网蛋 白、生长因子、细胞间相互作用蛋白、黏附蛋白和基质蛋白。
[0008] 植入到BM专用食的细胞总数构成HSC移植成功的基础。为了完成植入，移植到血 液循环的供者HSC应该归巢到其产生功能性血细胞生成集落化ematopoiesisfoci)的受 者骨髓中。运些灶的数目可从输注的HSC总数乘W其植入效率的积来推算。
[0010] 间充质基质细胞（MesenchymalstromalCell) (MSC)为异质细胞群，能够分化为 不同类型的成熟间充质细胞。运些细胞受到各种生物活性因子影响而分化为网状内皮细 胞、成纤维细胞、脂肪细胞和骨祖细胞（osteogenicprecursorcell)。
[0012] 显然，MSC对造血植入的贡献在于：产生帮助介导并平衡所移植服C的归巢、 自我更新和定向潜能的服C支持性细胞因子；复原受损的服C归巢和增殖所需造血微 环境；W及抑制源自供者的T细胞（可引起移植物抗宿主病（Gv皿)），[化arbordP.和 Moore，K. ,Ann.N.Y.Acad.Sci. 1044:159-167(2005);美国专利第 6, 010, 696 号；第 6555374 号]。例站!，在Maitra的研究中[MaitraB等，BoneMarrowTransplant. 33 化）：597_604. (2004)]发现在NOD-SCID小鼠模型中，人间充质干细胞支持非亲缘供者造血干细胞和受抑 制的T细胞激活，表明非亲缘源自人骨髓的MSC可改进同种异体移植结果。
[0013] 使用MSC的一个主要障碍是难W分离大量的运些正常存在的细胞群，其从技术上 来说是困难的且耗费大，部分是由于细胞数量有限。MSC最明显的来源是骨髓，但设及获得 骨髓吸出物和活检风险的显著不便之处成为运些方法的缺点。人胚胎和胎儿形成独立生命 运一普遍持有观点使得人胚胎作为干细胞来源有了疑问，在已经存在的逻辑困难之上又增 加了宗教和伦理方面的问题。
[0014] 近来已在尝试从备选来源中发现可收获的干细胞。运样的备选来源有例如：月旨 肪组织、毛囊、睾丸、人嗅粘膜、胚胎卵黄囊、胎盘、青少年皮肤和血液（例如厮带血甚至月 经血）。然而，从备选来源收获足够量的干细胞用于治疗和研究目的仍受限制且通常是 费事的，其设及例如从供者对象或患者收获细胞或组织、体外培养和/或繁殖细胞、解剖 (dissection)等等。
[0018] 解决MSC量有限问题的另一方法是用不同的培养条件离体扩增运些细胞[例如 美国专利第 6, 326, 198 号；第 6030836 号；第 6555374 号；第 6, 335, 195 号；第 6, 338, 942 号]。然而，运样的方法的缺点仍在于耗时、需要特定选择和分离程序，使得运些方法花费 大、难实施。
[0020] 在美国专利第6, 022, 743号中提出粘附基质细胞的S维框架，在化ssein化a星空体育登录入口 星空体育在线官网ni，H 等，[Tissue化gineering1U9-10) :1476-1488(2005)]中提出海绵胶原作为 3D基质。然 而，运些研究中无一曾提及在运些条件下生长的MSC用于在HSC移植后支持体内植入服C 的用途。还需要耗时来为特定细胞类型优化各种条件（例如灌注条件）或各种分离技术。
[0021] 在美国专利第7045148号和美国专利申请第号、第号 和第2005011871号中提出灌注的产后胎盘作为3D反应器用于培养MSC的用途。然而，该 方法受限于要待到胎盘分离后24小时并设及灌注，因此，细胞的群集生长（massgrowth) 且其在延长的时间周期内维持是不可能的。
[0022] 因此，普遍公认需要且将极为有利的是具备：不存在上述限制的新颖的细胞扩增 方法和藉此产生的细胞及条件培养基用于治疗的用途。
[0024] 本发明一方面提供细胞扩增方法，所述方法包括在支持细胞扩增的=维培养条件 下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞。
[0025] 本发明另一方面提供产生条件培养基的方法，所述方法包括：在允许细胞扩增的 =维培养条件下培养来自
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