(72)发明人金姆·西恩·迪伊·阮托马斯·帕特里克·斯塔兹亚历山大·L·霍华德
本发明描述的实施方式涉及在中空纤维生物反应器中生长细胞的方法和系统。在实施方式中,细胞可暴露于激活细胞扩增的激活剂。在实施方式中,细胞可包括T细胞,且激活剂可为不同形式,包括例如抗原递呈细胞或经抗体功能化的珠子。
将含白细胞的第一多个细胞引入到中空纤维生物反应器中,其中,所述中空纤维生物反应器包括多个中空纤维,
将所述第一多个细胞暴露于激活剂,以激活在所述中空纤维生物反应器中的细胞的扩增,
使在所述生物反应器的多个中空纤维中的所述第一多个细胞的至少一部分扩增,以生成第二经扩增的多个细胞,以及
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一多个细胞的一部分包含T细胞。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,使用白细胞去除术生成所述第一多个细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,在没有额外纯化的情况下,将所述第一多个细胞添加到所述中空纤维生物反应器中。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,所述暴露包括将所述第一多个细胞暴露于珠子,所述珠子在它们的表面上包含所述激活剂。
9.根据权利要求7所述的方法,其中,所述暴露包括将所述第一多个细胞暴露于含所述激活剂的树突细胞。
11.根据权利要求8所述的方法,其中,所述激活剂包含选自由抗CD2的抗体、抗CD3的抗体、抗CD28的抗体和它们的组合组成的组中的一种或多种抗体。
13.根据权利要求11所述的方法,其中,所述扩增包括使培养基在所述中空纤维生物反应器中循环。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,所述培养基包含白介素2(IL‑2)、白介素4(IL‑
4)、白介素5(IL‑5)、白介素7(IL‑7)、白介素15(IL‑15)和它们的组合中的一种或多种。
中空纤维生物反应器,所述中空纤维生物反应器包括具有至少相对端部的第一流体流动路径,其中所述第一流体流动路径的第一相对端部与所述中空纤维生物反应器的第一端口流体相连,并且所述第一流体流动路径的第二端部与所述中空纤维生物反应器的第二端口流体相连,其中所述第一流体流动路径包括所述中空纤维生物反应器的毛细管内部,
与所述第一流体流动路径流体相连的流体输入路径,其中多个细胞通过第一流体输入路径被引入到所述第一流体流动路径中,
内存,所述内存用于储存指令,在所述处理器执行所述指令时,所述指令进行包括以下步骤的方法,
将含第一多个细胞的第一流体引入到所述中空纤维生物反应器的毛细管内部中,所述
将所述第一多个细胞暴露于所述毛细管内部中的第一激活剂,以激活所述中空纤维生物反应器中的细胞的扩增,
将含培养基的第二流体引入到所述毛细管内部中,以使所述第一多个细胞的至少一部分扩增,并且生成第二经扩增的多个细胞,以及
17.根据权利要求16所述的系统,其中,所述第二经扩增的多个细胞包含T细胞。
18.根据权利要求14所述的系统,其中,所述第一流体包含珠子,所述珠子在它们的表面上包含所述第一激活剂。
19.根据权利要求18所述的系统,其中,所述激活剂包含选自由抗CD2的抗体、抗CD3的抗体、抗CD28的抗体和它们的组合组成的组中的一种或多种抗体。
20.根据权利要求19所述的系统,其中,所述培养基包含选自由白介素2(IL‑2)、白介素4(IL‑4)、白介素5(IL‑5)、白介素7(IL‑7)、白介素15(IL‑15)和它们的组合中的一种或多种细胞因子。
[0001]本申请是2016年05月12日递交的申请号为5.8,发明名称为“细胞扩增”的分案申请。
[0003]本专利申请要求于2015年5月13日递交名称为“细胞扩增(CELLEXPANSION)”美国临时专利申请号62/161,128的优先权,该美国临时专利申请通过引用整体并入本文中,如同全文在本文中示出一样。
[0004]细胞扩增系统(CES)可用于扩增多种细胞类型并且使多种细胞类型分化,这些细胞类型可用于研究和治疗目的。作为一个实例,T细胞疗法(例如自体T细胞疗法)是用于治疗很多疾病的新兴技术。经基因工程处理过且经离体扩增的T细胞例如可示出有希望治疗一些白血病(例如B细胞)和其它癌症。目前,T细胞的扩增可在袋状系统,或不完全自动化且还未功能性封闭的系统中进行。
[0005]鉴于这些和其它考虑,进行了实施方式。但是,上面讨论的相对具体的问题不限制本公开的实施方式的适用性。
[0006]本公开提供了简要描述,来以特定形式引入一些实施方式的各方面,这并不旨于确定关键或必要元素,也不旨于限制权利要求书的范围。
[0007]实施方式涉及细胞扩增系统(CES)和使细胞扩增系统的生物反应器中的细胞生长的方法。实施方式提供了用于使生物反应器,如中空纤维生物反应器,中的细胞扩增的方法。实施方式可提供将细胞(例如T细胞)引入到中空纤维生物反应器中,其中所述中空纤维生物反应器包括多个中空纤维。实施方式可提供将第一多个细胞暴露于激活剂,以激活在所述中空纤维生物反应器中的细胞的扩增。在实施方式中,所述激活剂可以是细胞、经固定的抗原(例如固定在珠子上)或可溶性抗原。在将细胞暴露于所述激活剂之后,细胞可扩增,以生成第二经扩增的多个细胞。然后,可从生物反应器中移出所述第二经扩增的多个细胞。
[0008] 其它实施方式提供了用于扩增细胞的细胞扩增系统。在实施方式中,所述系统包括中空纤维生物反应器,所述中空纤维生物反应器包括具有至少相对端部的第一流体流动路径,其中所述第一流体流动路径的第一相对端部与所述中空纤维生物反应器的第一端口流体相连,并且所述第一流体流动路径的第二端部与所述中空纤维生物反应器的第二端口流体相连,其中所述第一流体流动路径包括所述中空纤维生物反应器的毛细管内部。与所述第一流体流动路径流体相连的流体输入路径可用于将多个细胞引入到所述第一流体流动路径。实施方式可进一步包括用于使流体在所述第一流体流动路径中循环的泵。
[0009] 系统可包括用于执行指令的处理器,以便在所述处理器执行指令时,进行包括以下步骤的方法,将含第一多个细胞的第一流体引入到所述中空纤维生物反应器的毛细管内部中,所述第一多个细胞包含白细胞。所述处理器可进一步执行指令,该指令用于将所述第
一多个细胞暴露于毛细管内部中的第一激活剂,以激活所述中空纤维生物反应器中的细胞的扩增。所述处理器可执行指令,该指令用于将含培养基的第二流体引入到所述毛细管内部,以使所述第一多个细胞的至少一部分扩增,并且生成第二经扩增的多个细胞。所述处理器可执行指令,该指令用于从所述生物反应器移出所述第二经扩增的多个细胞。
[0012] 图2示出了根据实施方式的具有预安装的流体输送装置的细胞扩增系统的透视图。
[0019] 图9示出了根据实施方式,示出在培养期间的多个时间点处的总细胞计数的柱状图。
[0020] 图10示出了根据实施方式,示出在培养期间的多个时间处的细胞存活率的柱状图。
[0021] 图11示出了根据实施方式,示出对于经纯化的和未经纯化的初始细胞加载的树突细胞计数的柱状图。
[0022] 图12示出了根据实施方式,示出在培养期间的多个时间点处(且使用多种初始细胞加载纯度)的总细胞计数的柱状图。
[0023] 图13示出了根据实施方式,示出在培养期间的多个时间点处(且使用多种初始细胞加载纯度)的细胞存活率的柱状图。
[0025] 图15示出了根据实施方式,对比了多种细胞因子组合和递送方法的柱状图。
[0026] 图16示出了根据实施方式,示出在不同循环速率和反应器移动的情况下的细胞存活率的柱状图。
[0027] 图17示出了根据实施方式,示出在以不同细胞因子组合进行培养期间的多个时间点处收获的总细胞的柱状图。
[0028] 图18示出了根据实施方式,示出使用不同激活剂的细胞产量的柱状图。
[0029] 图19示出了根据实施方式,示出使用不同激活剂的细胞表型的柱状图。
[0032] 通过参考下面的详细描述和在附图中描绘的实施方式,可以进一步理解本公开的
原理。应理解,尽管下文相对于具体实施方式示出和描述了特定的特征,但本公开并不局限于下文描述的实施方式。
[0033] 现在将详细参考附图示出的和下文描述的实施方式。在附图和说明书中尽可能使用相同的附图标记来表示相同或相似的部件。
[0034] 参照图1 ,示出了可用于本公开的中空纤维生物反应器100的实例的正面立视图。中空纤维生物反应器100具有纵轴线LA‑LA,且包括腔室壳体104。在至少一个实施方式中,腔室壳体104包括四个开口或端口,IC入口108、IC出口120、EC入口128和EC出口132。
[0035] 根据本公开的实施方式,第一循环路径中的流体通过位于中空纤维生物反应器100的第一纵向末端112的IC入口108进入中空纤维生物反应器100,进入且穿过多个中空纤维116的毛细管内侧(在多个实施方式中被称为中空纤维膜的毛细管内(“IC”)侧或“IC空间”) ,且通过位于中空纤维生物反应器100的第二纵向末端124的IC出口120流出中空纤维生物反应器100。IC入口108和IC出口120之间的流体路径界定了中空纤维生物反应器100的IC部126。第二循环路径中的流体通过EC入口128流入中空纤维生物反应器100,与中空纤维116的毛细管外侧或外部(被称为膜的“EC侧”或“EC空间”)接触,且经由EC出口132离开中空纤维生物反应器100。EC入口128和EC出口132之间的流体路径包括中空纤维生物反应器100的EC部136。经由EC入口128进入中空纤维生物反应器100的流体可与中空纤维116的外部接触。小分子(例如离子、水、氧、乳酸盐等)可穿过中空纤维116从中空纤维的内部或IC空间扩散至外部或EC空间,或从EC空间扩散至IC空间。大分子量的分子,如生长因子,通常太大而不能穿过中空纤维膜,从而留在中空纤维116的IC空间中。在实施方式中,可根据需要更换培养基。培养基也可循环穿过氧合器或气体转移模件,以根据需要交换气体(参见例如细胞扩增系统500(图5)和600(图6) ) 。如下文所述,细胞可被包含在第一循环路径和/或第二循环路径内,并且根据实施方式,细胞可处于膜的IC侧和/或EC侧。
[0036] 用于制作中空纤维膜的材料可以是能制成中空纤维的任意生物相容性聚合材料。根据本公开的实施方式,可使用的一种材料是合成的聚砜类材料。为了使细胞附着至中空纤维的表面,该表面可以某些方式,通过使用蛋白如纤连蛋白或胶原蛋白至少涂敷细胞生长表面,或通过将表面暴露于辐射进行改性。伽马处理膜表面允许贴壁细胞的附着,且不需要额外使用纤连蛋白等来涂敷膜。由经伽马处理的膜制成的生物反应器可重复使用。根据本公开的实施方式,可使用用于细胞附着的其它涂层和/或处理。
[0037] 转向图2,示出了根据本公开的实施方式的具有预安装的流体输送组合件的细胞扩增系统200。CES 200包括细胞扩增仪202,其中细胞扩增仪202包括用于与细胞扩增仪202的后部206接合的舱口(hatch)或可关闭的门204。细胞扩增仪202的内部空间208包括适于接收和接合预安装的流体输送组合件210的特征,其中预安装的流体输送组合件210包括生物反应器100。预安装的流体输送组合件210可拆卸地附接到细胞扩增仪202,以便于使用在细胞扩增仪202处的新的或未使用的预安装的流体输送组合件210相对快速地更换同一细胞扩增仪202处的使用过的预安装的流体输送组合件210。单个细胞扩增仪202可经操作以使用第一预安装的流体输送组合件210来生长或扩增第一组细胞,之后可用于使用第二预安装的流体输送组合件210来生长或扩增第二组细胞,而不需要在将第一预安装的流体输送组合件210更换为第二预安装的流体输送组合件210之间进行消毒。预安装的流体输送组合件包括生物反应器100和氧合器或气体转移模件212。根据实施方式,管道引导槽示为
[0038] 接下来,图3示出了根据本公开的实施方式,在可拆卸地附接预安装的流体输送组件210(图2)之前的细胞扩增仪202的后部206。图3中省略了可关闭的门204(图2中所示) 。细胞扩增仪202的后部206包括用于与预安装的流体输送组合件210的元件组合工作的若干不同的结构。更具体地,细胞扩增仪202的后部206包括用于与预安装的流体输送组合件210上的泵回路配合的多个蠕动泵,包括IC循环泵218、EC循环泵220、IC输入泵222以及EC输入泵
224。此外,细胞扩增仪202的后部206包括多个阀,包括IC循环阀226、试剂阀228、IC培养基阀230、排气阀232、细胞输入阀234、清洗阀236、分配阀238、EC培养基阀240、IC废液阀242、EC废液阀244和收获阀246。几个传感器也与细胞扩增机202的后部206相关联,包括IC输出压力传感器248、组合IC输入压力和温度传感器250、组合EC输入压力和温度传感器252以及EC输出压力传感器254。还示出了用于排气腔室的光学传感器256。
[0039] 根据实施方式,图3示出了用于使生物反应器100旋转的轴或摇杆控件258。与轴或摇杆控件258关联的轴配件260能使轴接入孔与细胞扩增仪202的后部206适当对准,其中轴接入孔参见例如管道组织器的424(图4) ,参见例如预安装的输送组合件210或400的300(图
4) 。轴或摇杆控件258的旋转将旋转运动传递给轴配件260和生物反应器100。因此,当CES 200的操作者或使用者将新的或未使用的预安装的流体输送组合件400(图4)附接到细胞扩增仪202时,对准是适当确定预安装流体输送组合件210或400的轴接入孔424(图4)与轴配件260的方向的相对简单的事情。
[0040] 转向图4,示出了可拆卸附接的预安装的流体输送组合件400的透视图。预安装的流体输送组合件400可拆卸星空体育登录入口 星空体育在线官网地附接到细胞扩增仪202,以便于使用细胞扩增仪202处的新的或未使用的预安装的流体输送组合件400相对快速地更换同一细胞扩增机202处的使用过的预安装的流体输送组合件400。如图4所示,生物反应器100可附接到包括轴配件402的生物反应器联接件。轴配件402包括一个或多个轴紧固机构,例如用于接合轴,如细胞扩增仪202的258(图3中所示) ,的斜臂或弹簧构件404。
[0042] 根据实施方式,预安装的流体输送组合件400包括管道408A、408B、408C、408D、408E等,以及提供如下所述的图5至图9中示出的流体路径的各管道配件。还可为泵提供泵
回路406A、406B和406C。在实施方式中,尽管可在细胞扩增仪202所在的位置设置各种培养基,但根据实施方式,预安装的流体输送组合件400可包括足够的管道长度以延伸到细胞扩增仪202的外部,并能够焊接至与培养基袋关联的管道。
[0043] 图5示出了细胞扩增系统500的实施方式的简图,图6示出了细胞扩增系统600的另一实施方式的简图。在图5和图6所示的实施方式中,且如下所述,细胞生长在IC空间中。然而,本公开不局限于这些实施例,在其它实施方式中可提供要在EC空间中生长的细胞。
[0044] 根据实施方式,图5示出了CES 500,其包括第一流体循环路径502(也称为“毛细管内回路”或“IC回路”)和第二流体循环路径504(也称为“毛细血管外回路”或“EC回路”) 。第一流体流动路径506可与中空纤维生物反应器501流体相连,以至少部分地形成第一流体循环路径502。流体通过IC入口501A流入中空纤维生物反应器501 ,流过中空纤维生物反应器501中的中空纤维,并经由IC出口501B离开。压力计510测量离开中空纤维生物反应器501的培养基的压力。培养基流过可用于控制培养基流动速率/流体循环速率的IC循环泵512。IC 循环泵512可沿第一方向(例如顺时针方向)或与第一方向相反的第二方向(例如逆时针方向)泵送流体。出口501B可用作反方向的入口。然后,进入IC回路502的培养基可穿过阀514进入。如本领域技术人员应理解的,额外的阀和/或其它装置可放置于各位置,以沿流体路径的多个部分分离培养基和/或测量培养基的特征。相应地,应理解所示简图表示CES 500的各元件的一种可能的配置,对所示简图的修改在一个或多个本公开的实施方式的范围内。
[0045] 对于IC回路502,可在操作期间从样本口516或样本圈518获得培养基的样本。设置在第一流体循环路径502中的压力/温度计520允许在操作期间检测培养基的压力和温度。然后,培养基返回到IC入口501A以完成流体循环路径502。在中空纤维生物反应器501中生长/扩增的细胞可从中空纤维生物反应器501中冲洗出来,穿过阀598进入收获袋599中,或者在中空纤维内重新分布以进一步生长。下文将对此进行更详细地描述。
[0046] 第二流体循环路径504中的流体经由EC入口501C进入中空纤维生物反应器501 ,并且经由EC出口501D离开中空纤维生物反应器501。EC回路504中的培养基可与中空纤维生物反应器501中的中空纤维的外部接触,从而能使小分子扩散进入和离开中空纤维。
[0047] 设置在第二流体循环路径504中的压力/温度计524允许在培养基进入中空纤维生物反应器501的EC空间之前测量培养基的压力和温度。压力计526允许在第二流体循环路径504中的培养基离开中空纤维生物反应器501之后测量其压力。对于EC回路,可在操作期间从样本口530或样本圈获得培养基的样本。
[0048] 在实施方式中,在离开中空纤维生物反应器501的EC出口501D之后,第二流体循环路径504中的流体穿过EC循环泵528到达氧合器或气体转移模件532。EC循环泵528还可沿相反的方向泵送流体。第二流体流动路径522可经由氧合器入口534和氧合器出口536与氧合器或气体转移模件532流体相连。在操作中,流体培养基经由氧合器入口534流入氧合器或气体转移模件532,并且经由氧合器出口536离开氧合器或气体转移模件532。氧合器或气体转移模件532向CES 500中的培养基添加氧,并从中除去气泡。在各实施方式中,第二流体循环路径504中的培养基可与进入氧合器或气体转移模件532的气体处于平衡状态。氧合器或气体转移模件532可是任何适当尺寸的氧合器或气体转移装置。空气或气体经由过滤器538流入氧合器或气体转移模件532,并通过过滤器540流出氧合器或气体转移装置532。过滤器
538和过滤器540减少或防止氧合器或气体传递模件532和相关的培养基发生污染。在准备顺序部分中,从CES 500清除的空气或气体可经由氧合器或气体传递模件532排放到大气中。
[0049] 在CES 500所描绘的配置中,第一流体循环路径502和第二流体循环路径504中的流体培养基以相同方向(并流配置)流过中空纤维生物反应器501。CES 500还可被配置为以逆流形式流动。
[0050] 根据至少一个实施方式,含细胞(来自袋562)的培养基和来自袋546的流体培养基可经由第一流体流动路径506被引入到第一流体循环路径502中。流体容器562(例如,用于将空气引出系统的细胞输入袋或盐水准备流体)可经由阀564与第一流体流动路径506和第一流体循环路径502流体相连。
[0051] 流体容器或培养基袋,544(例如,试剂)和546(例如,IC培养基)可分别经由阀548和阀550与第一流体输入路径542流体相连,或经由阀548、阀550和阀570与第二流体输入路径574流体相连。还提供了第一和第二无菌可密封的输入准备路径508和509。排气腔室(ARC)556可与第一循环路径502流体相连。排气腔室556可包括一个或多个超声波传感器,包括上传感器和下传感器,以在排气腔室556内某些测量位置处检测空气,流体缺乏,和/或气体/流体界面,例如空气/流体界面。例如,超声波传感器可用于排气腔室556的底部附近和/或顶部附近,以检测这些位置的空气、流体和/或空气/流体界面。在不脱离本公开的精神和范围的情况下,实施方式使用了许多其它类型的传感器。例如,光学传感器可用于本公开的实施方式中。在准备事件部分或其它方案期间,从CES 500清除的空气或气体可经由可与排气腔室556流体相连的管线排放到大气中。