1.一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，包括以下步
2）制备高浓度钾离子培养基；所述高浓度钾离子培养基中氯化钾摩尔浓度为：45.33
T细胞混合，用0.5 ml所述高浓度钾离子培养基重悬得到细胞悬液；将所述细胞
7）培养9天后，当所述T细胞生长进入平台期时进行杀伤试验检测体外杀伤效率；
所述步骤3）的所述磁珠悬液通过以下步骤制备获得：a)在200万个CD3/CD28细胞扩增
磁珠，加入5倍体积所述高浓度钾离子培养基；b)用磁铁吸附所述CD3/CD28细胞扩增磁珠，
除去液体完成一次洗涤，重复步骤a)和步骤b）三次后用0.5 ml所述高浓度钾离子培养基重
所述步骤5）具体为：培养5天后，通过吹吸将改造后的所述T细胞与所述磁珠分离，使用
所述步骤6）的具体步骤为：将所述T细胞置于6孔细胞培养板中，按50万所述T细胞每毫
升添加新的所述高浓度钾离子培养基继续培养，培养7～8天后，按50万所述T细胞每毫升添
2.如权利要求1所述的T细胞体外星空体育 星空体育平台嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在
3.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在
于，步骤4）的具体为：加入装载CAR T基因的慢病毒并添加所述高浓度钾离子培养基至孔内
液体满，培养3天后，吸去2ml培养上清，添加2ml新的所述高浓度钾离子培养基。
4.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在
疗，非特异性免疫调节治疗，免疫检查点阻断治疗和单克隆抗体治疗等。其中，嵌合抗原受
前最重要的肿瘤免疫治疗方法之一，其主要治疗流程是通过慢病毒等方式改造病人外周血
T细胞需要两个信号来激活，一般通过T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别抗
一信号，并同时通过T细胞表面的共刺激分子和APC或靶细胞上的配体结合以获得第二信
号。两者共同作用激发下游级联反应使得T细胞激活和增殖并进行细胞杀伤等。鉴于第一信
号会受到组织相容性复合体(MHC)限制的问题，为了摆脱这一限制，CAR T细胞主要通过表
达嵌合抗原受体分子，直接与抗原受体结合并激活胞内信号以激活T细胞。在进行CAR T治
疗时，需要从病人外周血中分离T细胞，并对T细胞进行体外培养以及改造。但如何改进其体
外培养条件，以增加T细胞后续杀伤能力至关重要，将直接影响CAR T治疗效果而具有重要
与坏死的密集区域。在细胞坏死后，胞内离子释放造成肿瘤间质液(TIF)中局部离子失衡，
钾离子高于血清中浓度并且抑制T细胞的效应子功能。进一步的研究显示，胞外高浓度的钾
优化培养方法，通过优化钾离子浓度培养基代替普通培养基进行CAR T细胞的体外培养和
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何加强CAR T细胞
T细胞混合，用0.5ml高浓度钾离子培养基重悬得到细胞悬液；将细胞悬液加入24孔细
进一步地，高浓度钾离子培养基中氯化钾的质量浓度为：2500～4800mg/L。
进一步地，步骤3)的磁珠悬液通过以下步骤制备获得：a)在200万个CD3/CD28细胞
扩增磁珠，加入5倍体积高浓度钾离子培养基；b)用磁铁吸附CD3/CD星空体育 星空体育平台28细胞扩增磁珠，除去
液体完成一次洗涤，重复步骤a)和步骤b)三次后用0.5ml高浓度钾离子培养基重悬得到磁
进一步地，步骤4)的具体为：加入装载CAR T基因的慢病毒并添加高浓度钾离子培
养基至孔内液体满，培养3天后，吸去2ml培养上清，添加2ml新的高浓度钾离子培养基。
进一步地，步骤5)具体为：培养5天后，通过吹吸将改造后的T细胞与磁珠分离，使
进一步地，步骤6)具体步骤为：将T细胞置于6孔细胞培养板中，按50万T细胞每毫
升添加新的高浓度钾离子培养基继续培养，培养7～8天后，按50万T细胞每毫升添加新的高
1、本发明中，使用了优化钾离子浓度培养基代替普通培养基进行CAR T细胞的体
图1是T细胞在不同培养条件下的生长曲线天，Meso‑CAR的表达检测结果示意图；
图7是在不同条件培养下，Meso‑CAR T细胞对不同靶细胞的杀伤效率对比示意图。
于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限
本实施例使用高浓度钾离子培养基，在体外改造靶向间皮素(Mesothelin)的
Meso‑CAR，并用常规培养作为阴性对照。培养期间记录细胞生长曲线，CAR感染效率，CD4
T细胞扩增情况以及细胞表面PD‑1的表达。细胞进入静息状态后，将细胞与表达间皮素
本实施例中，氯化钾的质量浓度为：3400mg/L，摩尔浓度为：45.33mM；氯化钠的质
3)磁铁吸附磁珠，除去液体，用0.5ml高浓度钾离子培养基，对照组加入等量常规
5)将步骤1)中细胞悬液加入24孔细胞培养板中，再逐滴滴加步骤4)中磁珠悬液；
7)培养24小时后，加入装载CAR T基因的慢病毒，并添加高浓度钾离子/常规培养
8)培养3天后，吸去2ml培养上清，添加2ml新的高浓度钾离子/常规培养基；
9)培养5天后，吹吸分离细胞与磁珠，使用磁铁除去磁珠。进行CD4/CD8/PD‑1染色；
10)对照组的细胞分别平均置于六孔细胞培养板的两个孔中，按50万个细胞每毫
升添加新的高浓度钾离子培养基，对照组加入等量常规培养基继续培养。高浓度钾离子激
11)培养7天后，按50万个细胞每毫升添加新的高浓度钾离子培养基。进行Meso‑
使用荧光素酶靶细胞杀伤实验检测改造后的T细胞的体外杀伤效率，具体步骤为：
2)根据CAR表达的阳性率，将实验组与未感染慢病毒的对照组混合，在96孔板中接
个相同阳性率的CAR T细胞，按照E：T＝1：1/5：1的比例加入表达Luciferase的肿
8)计算杀伤效率，杀伤效率＝(1‑实验组荧光强度/无T细胞对照组荧光强度)×
造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员
依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术