，是描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是
这是因为随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭、反应副产物焦磷酸对合成反应的阻碍等原因，致使PCR并非一直呈指数扩增，而最终将进入平台期。由于影响PCR扩增的因素错综复杂，因此每次PCR扩增时进入平台期的时机及信号高低变化很大，很难准确控制。
同一样品重复进行96次 Time PCR扩增时的实时监测结果，从这张图上我们可以看出，尽管平台期的变化很大，但在扩增曲线的指数增长区的某一区域，重复性非常好，这对PCR的定量分析非常重要。如果在扩增曲线的指数增长区适当位置设定荧光检出界限值，即阈值（Threshold），就会得到阈值与扩增曲线的交点Ct值，Ct值是指达到阈值时的循环圈数（Threshold Cycle）。经数学理论证明，Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系。
在定量分析上，RealTimePCR与以往普通PCR的终点定量法的本质区别，在于可以实时监控PCR扩增产物，并且在指数扩增期进行准确定量。
PCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久达到平台期。起始DNA量越多扩增产物量便越早达到检出值也就是扩增曲线越早起峰。我们将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模板数的对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图所示的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，也可以得到Ct值，并将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量，这就是Real Time PCR的定量原理。
Ct值的计算方法有两种。一种是交点法（Crossing Point法），是通过阈值和扩增曲线的交点计算Ct值的方法。另一种是二次求导法（2nd Derivative Maximum法），是通过扩增曲线二次求导后取其最大的点计算Ct值的方法。交点法因为是在指数扩增区域的任意位置设定阈值而进行解析，其Ct值会随着阈值的设定位置不同而发生变化，所以容易产生较大的实验间的误差。二次求导法因为是以扩增速度的变化率最大点计算Ct值，不会随阈值的设定不同而变化所以重现性高。另外，还能排除仪器检出误差的影响，是一种高准确度的计算方法。
原因：在模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性而直接导致复孔之间的Ct值差异较大。
解决方法：如果溶解曲线呈单峰，且NTC与目的基因孔的Ct差异在3以上，说明实验是准确的。实验时可以加大复孔的数量，选择差异较小的进行数据分析即可。
原因分析：此情况下一般NTC的Tm值与目的基因的Tm值较低，主要是因为引物二聚体造成。
若 △CT ≥ 5，说明气溶胶带来的污染对体系影响非常小，可以忽略不计；如果达不到 △Ct≥5的程度，△Ct≥3也可以认为气溶胶的污染程度很低，目的基因的Ct值可正常使用；若△Ct＜3，说明污染已经很严重，目的基因的Ct值是不能使用的。
解决方法：可通过1%琼脂糖凝胶电泳对RNA质量进行检测；降解严重的样品应重新提取RNA，优化提取过程。一般情况下Ct≥35数据可信度较低，所以最好保持Ct在34一下最好。
问题分析：基因得扩增效率降低导致Ct值偏大；基因本身的转录水平低导致的Ct偏大；
解决方法：可将基因的扩增产物进行梯度稀释，同时进行 qPCR，将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算。通过标星空体育官方入口 星空体育官网准曲线可以得到线性方程，将线性方程得到的斜率(K)带入扩增效率计算公式中：e=10[-1/k]-1；只有当扩增效率满足90~120%，且标准曲线，引物的扩增效率才是合格的，定量出来的Ct值才可以用来计算，且扩增效率越接近100%，引物的扩增性能越优；若判断为扩增效率较低，主要为反应条件不适宜或者引物设计不合理，应重新优化反应体系或者引物设计。
基因本身的转录水平低可以适当提高上样模板的量以降低Ct值在合理的范围之内。
解决方法：增加循环数或者增加上样的模板量，或选择适用于低丰度模板的试剂盒。
解决方法：可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。
解决方法：增加循环数，一般设置到40即可；检查qPCR反应程序，添加荧光信号采集步骤；可能为目的基因的含量低导致，可用高浓度的上样量进行试验，或者重新提取模板进行试验；
：进行一次qPCR实验都会让我们多多少少付出一定的心血，所以为了能够尽可能的使试验成功，建议大家在进行实验之前，最好和实验室的前辈多进行交流，能够从样品的准备和RNA的提取到耗材的选择得到最合适的方案，能够大大提高实验成功的机会。最后祝大家实验顺利，高分文章冲冲冲！！！