ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJcelJM IIm—nm—no1)—2010,—26(9 945 VEGF，观察是否会产生如同CD40配体诱发的细胞 [3]HollmannCA，OwensT，NalbantogluJ，eta1．Constitutiveactivation ofextracellularsignal—regulatedkinasepredisposesdiffuselargeB cell 增殖效应。结果显示，外源性 VEGF并不能有效促 lymphomacelllinestoCD40．mediatedcelldeath[J]．CnacerRes， 进AGS增殖 (数据未 出示)，这一结果也说 明了 2006，66(7)：3550—3557． CD40配体诱导细胞增殖所涉及的过程非常复杂，并 [4]SabelMS，YamadaM，KawangchiY，eta1．CD40expressionoffhu— 不是单单依赖于促进VEGF的分泌，而应该是 VEGF manlungcancercorrelateswithmetastaticspread[J]．CancerImmu— 受体信号与CD40分子配基化的联合效应。 nolImmunother，2000，49(2)：101—108． 综上所述，CD40分子对 胃癌细胞AGS的生长增 [5]MatsuzawA，TsengPH，VallabhapurapuS，eta1．Essentialcytoplas— mictranslocation ofacytokinereceptor—assembled signalingcomplex 殖起着重要的作用，它与CD40配体的结合可以促进 [J]．Science，2008，321(5889)：663—668． 细胞大量分泌VEGF，激活VEGF星空体育网站 星空体育首页受体信号通路，从而 [6]庞雪芹，陈卫昌，李 锐，等．激发CD40信号对胃癌细胞株生长 诱导细胞的增殖。因此，在 以CD40为靶分子的肿瘤 增殖及基因表达谱的影响[J]．中华消化杂志，2007，27(11)： 治疗时，应避免选择这种激发方式，否则会适得其反。 732—735． [7]BergmannS，PandolfiPP．Givingblood：anewroleforCIMOintu- morigenesis[J]．JExpMed，2006，203(11)：2409—2412． 参考文献： [8]FangJ，DiugM，YangL，etalPI3K／PTEN／AKTsingalingregulates [1]QuezadaSA，JarvinenLZ，LindEF，eta1．CD40／CD154interactions prostatetumorangiogenesis[J]CellSignal，2007，19(12)：2487一 attheinterfaceoftoleranceandimmuni~[J]．AnnuRevImmunol， 2497． 2004，22：307—328． [9]KangJ，RyehahouPG，IsholaTA，eta1．N—mycisanovelregulatorof [2]QiCJ，ZhengL，MaHB，eta1．AnovelmutationinC1M0andits PDK—mediatedVEGFexpressioninneuroblastoma[J]．Oncogene， functionalcharacterization[J]．Hum Mutat，2009，30(6)：985— 2008，27(28)：3999—4007． 994 ◆ i ● ◆ ● ● ◆ ◆ i● ◆ ● ● ◆ ◆ i ● ◆ ● i● ◆ ● ◆ ◆ ● ii◆ ◆ ● iI◆ ● ◆ i● ◆ ◆ i◆ ．e- ◆ ◆ ● ii● ◆ ● ◆ ● ● i● ◆ ● ii● ● · 论著 · 文章编号：1007—8738(2010)09—0945—02 TAT．HOXB4蛋 白对脐血 CD34+ 我们旨在研究TAT—HOX1M作为干细胞生长因子与 其他干细胞生长因子一起对脐血CD34细胞进行体 细胞的体外扩增实验研究 外扩增培养的效果，为有效扩增 HSC提供新方法。 李 晶，陈 虎 (军事医学科学院附属医院移植科，北京 100039) 1 材料和方法 1．1 材料 IMDM购 自Gibco公司；胎牛血清购 自StemCell [摘 要] 目的：研究 rAT—HOXB4蛋白对脐血 CD34细胞的 Technologies公司；甲基纤维素购 自SIGMA公司；淋巴细胞 体外扩增效果。方法 ：采用磁珠阳性分离(MiniMARCS)纯化 分离液(Ficol1)购 白天津市川页生化制品有限公司；6孔板购 法分离纯化脐血 CD34 细胞；用造血干细胞体外悬浮培养法 自美国COSTAR公司；倒置显微镜购 自日本 Olympas公司； 以及流式细胞术检测法，观察应用TAT—HOXB4蛋 白对脐血 二氧化碳孵箱购 自日本 SANYO；离心机购 自上海安亭科学仪 CD34 细胞的体外扩增能力。结果：加入 TAT—HOXB4蛋 白 器厂；流式细胞仪购 自美国Beckman—Couher公司；培养所用 组的CD34 细胞数为对照组的13倍，MNC为对照组的6倍 ， 的干细胞 因子 (SCF)、白细胞介素3(IL一3)、白细胞介素6 并且在 实验 的第4天体外扩增效果最 明显。结论 ：TAT— (IL-6)购 自美国Piprotech；TAT—HOXB4蛋白购 自台湾尖端公 HOXB4蛋白对脐血CD34 细胞的体外扩增效果显著。 司。 [关键词]TAT—HOXlM蛋 白；CD34 细胞；扩增 1．2 方法 [中图分类号]R392．11 [文献标识码]B 1．2．1 分离纯化 CD34 细胞 采用 MiniMARCS分离法。采 用永定路医院正常足月顺产婴儿脐带血，EDTA抗凝。每份 造血干细胞移植是治疗血液系统疾病、实体瘤 脐血70～100mL，共收集两份脐血。EDTA抗凝脐血与生理 以及免疫免疫缺陷性疾病等的可靠选择 。足够数量 盐水 l：1，用相对密度为 1．073的Ficoll进行密度梯度离心， CD34分离Buffer反复洗涤2次，显微镜下计数。加入封闭抗 的造血千／祖细胞 (HSC／HPC)是造血干细胞移植成 体 100 及CD34mAb，4℃冰箱中孵育20rain，每隔1—2 功的前提条件，因此提高HSC／HPC在体外扩增效果 rain晃动使细胞与封闭抗体充分混合；洗涤两次后加人为磁 是实验室亟待解决的问题，并具有重要的临床意义。 珠标记的二抗 ，4℃冰箱中孵育20min，洗涤 2次后将细胞固 收稿 日期：2010—01—08； 接受 日期 ：2010—07—12 定在磁场 中细胞分离柱 ，去除未标记细胞，用 CD34分离 作者简介：李 晶(1983一)，女，山东济南人，医师，硕士生 Buffer加压洗脱，收集CD34细胞 ，备用 ，并作流式细胞术检 Tel Correspondingauthor 测，纯度均大于95％，达到实验要求。 ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMollmmuno1)2010，26(9 1．2．2 对脐血CD34 细胞体外扩增培养 培养体系为 IM— 成功并能长期造血重建至关重要…。因此，如何使 DM含 10％的胎牛血清，加入IL一3、IL-6、SCF、TPO、FL分别 HSC在体外扩增的同时又保持其 自我更新特征已成 为5、20、100、3、2 g／L，再用 IMDM定溶至 10mL，备用。 为 目前亟待解决的难题 J。作为转录因子的HOXB4 分为实验组和对照组两组，实验组是加入 TAT—HOXB4蛋白 是 目前被认为最有潜力的干细胞扩增工具之一， 以及以上干细胞培养体系，对照组不加人TAT—HOXB4蛋白， HOXB4不仅能促进 HSC的扩增及其功能的活化与 只加入以上干细胞培养体系，每组6个复孔。CD34 细胞以 表达，而且体内实验表明其不会诱发 白血病，这一 0．15×10。／孔接种。实验组每24h，将细胞再悬浮于含有 特性使HOXB4应用于临床的价值更明显 J。有实 TAT—HOXB4蛋白的新鲜培养体系中。 1．2．3 对CD34 细胞检测及MNC细胞计数 分别于培养第 验证明HOXB4蛋 白可在体外大量扩增HSC，且在扩 0、2、4(0d检测值作为扩增前数据)天进行单个核细胞 增后仍保有其原来的功能及特征，基于此HOXB4蛋 (MNC)计数及流式细胞术分析。 白备受关注_4j。还有研究表明，通过逆转录病毒将 1．2．4 统计学分析 分析数据均以 ±s表示，组间比较用t HOxB4基 因转染人培养的 鼠骨髓细胞，12d后 检验，P0．01为统计学有意义。所有统计学处理在SPSS13．0、 CFU—S和CFC的数量显著增加，且它们在首次和二 Excel2003软件中完成。 次培养时均能形成较大的克隆，同时HOXB4可明显 增强HSC的体内再植活性 J。Antonchuk等 报道， 2 结果 HOXB4在含IL-3、IL-6和SCF的培养体系中可显著 2．1 体外扩增培养过程 CD34 细胞变化趋势 分别在扩增 促 鼠HSC扩增达 40倍。研究表明，未转染HOXB4 的第0、2、4天行 CD34 细胞计数，以观察不同的时间点上 基因的小 鼠HSC经过 1O～14d的培养后，大部分丧 的细胞数 目变化 (图1)，第4天TAT．HOXB4实验组 CD34 细胞较对照组有明显的增高趋势 (P0．01)，组间差异具有 失了干细胞特性；而转染了HOXB4基因的HSC却 统计学意义。而第2天与第零天变化趋势均不明显，且第二 出现大量增殖，同时这些细胞仍具有全部的淋巴系一 天实验组与对照组差异不具有统计学意义。 髓系造血重建潜能，并且不具有致瘤性 ；这表明 HOXB4可介导HSC大量扩增，且扩增后的细胞仍然 保持原有功能。 本实验采用的HSC扩增工具是当前相关研究比 较热 门的重组人类TAT—HOXB4蛋 白。为此，本部分 实验由公司方面提供重组TAT．HOXB4蛋白，将这种 图1 CD34细胞在不同时间点的数 目变化 蛋 白作为一种培养因子，与其他的细胞因子共同作 用以达到更好的扩增效果。实验结果：扩增后的， 2．2 TAT-HOXB4蛋 白对 CD34 细胞及 MNC细胞的扩增 效果 实验第4天，检测 CD34 细胞数值及 MNC数值以及 CD34细胞数为对照组的13倍，MNC为对照组的6 计算CD34细胞率(表 1)。CD34细胞数值实验组与对照组 倍，由此可以证 明TAT．HOXB4蛋 白在体外扩增 具有显著差异(P0．01)，MNC数值实验组与对照组具有显 CD34 细胞的实验效果显著。 著差异 ，CD34 细胞率实验组与对照组具有显著差异 ，差异 均具有统计学意义(PO．01)。 参考文献： 表 1 TAT．HOXB4蛋白对CD34和MNC细胞的实验结果 [1]唐佩弦．造血干细胞研究发展历史引发的思考[J]．中国实验血 (n=6， 4-s) 液学杂志，2005，13：723—732． [2]WilsonA，TrumppA，Bone2marrowhaematopoietic2stem2cellniches [J]．NatRevImmunol，2006，6：93—106． [3]李 晶，陈 虎．HOXIM转录因子在造血干细胞中表达调控机 制的研究进展 [J]．中国实验血液学杂志，2008，16：960—963．
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