实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，运用Taq酶的5′-3′外切酶活性和荧光能量星空体育 星空体育平台传递技术，把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，对整个PCR反应扩增过程进行了实时监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，监测到的荧光信号随反应变化可以绘制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知核酸模板进行定量分析的方法。
整条曲线个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含量而进行定量分析。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针星空体育 星空体育平台为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
反应效率的最佳评估方法是生成标准曲线。通过构建连续稀释的样本核酸，并进行实时荧光定量PCR，生成标准曲线。然后以起始核酸量为X轴，以Ct为Y轴，绘制结果曲线。
用于生成标准曲线的样本 (尽可能接近) 应与将用于实验的样本匹配 (即相同的总 RNA 或 DNA 样本)。标准曲线分析的稀释范围或动态范围应涵盖实验样本预期的浓度范围。曲线的斜率可用于测定反应效率，100%效率代表每个循环中的模板均实现了完美倍增，但大多数科学家认为反应效率应在90%至110%之间。
效率在90–110%的理想窗口内的标准曲线确定了RT-qPCR反应可测量的起始模板量范围。某种程度上可通过靶点Ct在扩增曲线上出现的时间测定灵敏度。
但是，分析灵敏度的实际测量方法是特定少量的模板是否适用于标准曲线并维持理想的扩增效率。符合要求的稀释度最高的样本决定了反应灵敏度。
标准曲线值，用于测量重复样本的可重复性。重复标准曲线以评估一致性，从而保持样本的数据准确度。
RT-qPCR的常见困难可归结为四个主要方面：引物二聚体的形成、引物和探针的储存、实时荧光定量 PCR的抑制和较低的反应效率、软件分析设置。
适用广泛：支持血清、血浆、尿液、CSF、拭子浸泡液、培养液上清等多种样本；
Firegen VMTM为非灭活型鼻/口咽拭子保存液，在4℃至室温区间保持细胞及病毒的完整性。
[1]韦信贤,黎小正,童桂香,吴祥庆.实时荧光定量PCR技术及其在水生动物病毒病定量检测中的应用[J].水产科学,2010,29(11):681-687.