解密PCR那些奇奇怪怡的曲线图代表什么
的本质其实就是一变二、二变四、四变十六······产物呈指数增长的数字游戏。

因此,在引物、模板、缓冲液、酶等都充足的理想状态下,荧光定量PCR的扩增曲线应该是这样的:

然而,理想很疯狂,现实却很“性感”,看下面的“S型”曲线就知道,相对于理想状态下的扩增曲线,在dNTP和酶都有限的情况下,扩增曲线如下图所示,有一个平台期,酶逐渐失活,dNTP消耗殆尽,产物增加量逐渐减少;直至没有任何产物生成,数目保持恒定。

熔解曲线(Dissociation curve),就是随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。扩增反星空体育登录入口 星空体育在线官网应完成后,通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线。熔解温度上有一特征峰(Tm,DNA双链解链50%的温度),用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开,因为它们在不同的温度熔解度不一样。用荧光信号改变的负的一次导数(dR/dT)与温度作图,得出熔解曲线。
dR/dT 越大,表明荧光值变化最快。随着温度上升,达到Tm点时,大部分产物双链DNA解开,荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异,熔解曲线之间会形成一个单峰(温度和qPCR产物长度以及GC含量相关)。
SG法采用72℃ 延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
