nk细胞(naturalkiller，nk)是一类具有杀伤功能的天然免疫细胞，其表型为cd3-cd56+，在外周血中所占比较低，约5-15％。nk细胞活化后，可通过分泌颗粒酶、穿孔素等效应分子，非抗原特异性地高效杀伤肿瘤细胞。近年来，随着细胞治疗技术在临床的推广与应用，nk细胞因其非抗原特异性的杀伤特点，从而在肿瘤细胞免疫治疗中受到了重点关注。nk细胞不仅自身可直接作为杀瘤效应细胞应用，还可作为car-nk细胞的载体细胞。在nk细胞的体外扩增制备中，大多采用富含造血干细胞、前体细胞的骨髓细胞、脐带血及外周血单个核细胞(pbmcs)或es、ips细胞作为nk细胞的种子细胞进行活化、扩增。与抗原特异性细胞毒性t细胞(ctl)不同的是，nk细胞活化及其增殖不依赖抗原特异性受体的调控，而依赖其细胞表面活化性受体(kar)和抑制性受体(kir)的调节，如杀伤细胞免疫球蛋白样受体、nkp44、nkp46等。因此，nk细胞的体外扩增不能采用体外常规培养ctl细胞的方法进行。现有的nk细胞培养通常采用的体外扩增方法主要有：抗cd3/组合细胞因子扩增法、滋养细胞(feedercell)/细胞因子扩增法等。其中，常规的组合细胞因子扩增法通常采用抗cd3与其它细胞因子进行组合，其主要缺点是细胞在培养过程中，nk细胞扩增效率较低，且在培养中引入多种细胞因子，造成培养过程中的高成本。采用滋养细胞/细胞因子扩增法进行nk细胞的培养时，因常采用eb病毒转染的b淋巴母细胞系或基因工程修饰的k562细胞，从而使得培养的nk细胞不适合直接用于临床治疗。因此，如何能够建立适应临床治疗用的低成本、高效nk扩增培养体系，是当下nk细胞体外制备所要解决的重要技术问题。
现有体系中的技术缺陷主要有：细胞因子组合法的所用细胞因子种类多、成本高、扩增效率较低；细胞滋养法中因用到外源性细胞，不适合于临床治疗级细胞的培养。
中国专利cn8.9提供了一种无饲养层体外扩增原代nk细胞的培养组合物及其应用，同时涉及所获得的nk细胞及相关应用。本发明提供了一种用于培养nk细胞的组合物，该组合物包括活化培养基组合物和/或扩增培养基组合物，活化培养基组合物包括活化基础培养基、rhil-2、rhil-15、rhil-21、ok432、okt-3、以及anti-cd16mab或者anti-cd52mab；扩增培养基组合物包括扩增基础培养基、rhil-2、rhil-15、rhil-21及dst。上述专利中的技术的体系过于复杂。根据其专利说明书所述，在其nk细胞激活培养基中不但包括了3种活化性抗体(anti-cd16、anti-cd52、抗anti-cd3(即okt3))、3种细胞因子(il-2、il-21、il-15)及非特异性免疫激活剂ok432。其nk细胞增殖培养基中则含有3种细胞因子(il-2、il-21、il-15)。这种多组份的组合发生培养基首先导致了该nk细胞培养基的经济成本高；其次，因组份多导致其产品的稳定性质控难；第三，在其激活性培养基中加入了ok432，且ok432为不可缺少的必要成分。ok432是由溶血性链球菌su株经青霉素处理、冷冻干燥制成的菌苗。而患有由溶血性链球菌感染引起的风湿热和风湿性心脏病患者，以及有青霉素等过敏史者对ok432的应用是绝对禁忌的。
针对现有技术存在的技术问题，本发明选择了nk细胞表面的cd52作为激活靶分子，制备了抗cd52包被的免疫磁珠；并利用该免疫磁珠结合使用il-2，建立了扩增nk细胞的高效培养系统。该培养方法在避免使用滋养细胞的同时，减少加入细胞因子种类，简化操作步骤、降低了扩增成本，可用于临床级nk细胞的大规模制备。
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种无滋养细胞、低成本、操作简便的抗cd52结合il-2体外扩增nk细胞体系及培养方法，适用于临床实验研究及治疗用nk细胞的制备。
本发明的发明人对抗cd52的应用方式进行了优化，通过将抗cd52进行磁珠的固相化，提高了该抗体对nk细胞的激活效能。在实际应用中，尤其结合利用蛋白g预包被技术，通过蛋白g与抗cd52的fc段间天然结合特性，不但优化了抗cd52在磁珠表面的构象，而且提高了单位磁珠表面包被抗体的浓度，从而增强了单位磁珠星空体育官方入口 星空体育官网的抗体活性，强化了其激活效能。在整个体系中只有2种组份，即抗cd52免疫磁珠和il-2。不但降低了经济成本，操作简单、产品质量的可控性和重复性好。同时，本专利产品不存在由ok432此类菌苗制剂带来的临床应用中的禁忌。
发明人建立了一种以nk细胞表面膜分子cd52作为激活靶点，结合使用细胞因子白细胞介素-2(il-2)的nk细胞扩增培养系统。
一种nk细胞体外扩增体系，所述的nk细胞体外扩增体系包括用于细胞活化的活化培养基和用于细胞增殖的增殖培养基；
所述的活化培养基由活化剂和基础培养基组成，所述的活化剂为固相化抗cd52和il-2的组合；
优选地，所述的活化培养基中，抗cd52可以是抗cd52的任一固相化形态，例如包括但不限于抗cd52包被磁珠或抗cd52包被培养板。
优选地，所述的活化培养基中，cd52为抗cd52包被磁珠，抗cd52包被磁珠的使用剂量为1×105磁珠/ml-5×106磁珠/ml。更优选的使用剂量为4×105磁珠/ml。
1)将装有磁微球的管置于旋涡振荡仪上，打开仪器，振荡，充分混匀磁微球；2)吸取磁微球至无菌ep管；
3)将ep管中加入pbs缓冲液，旋涡重悬；将该ep管置于磁铁中，静置，使磁珠吸附于ep管磁铁一侧，吸去上清，加入pbs，重复洗涤，去上清；
6)将ep管放置于磁铁中，等磁珠完全吸附于磁铁一侧后，吸去上清，再加入pbs，重复洗涤3次；
7)加入三乙醇胺交联缓冲液于ep管中，轻轻振荡混匀；将ep管置于磁铁中，静置，待管中磁珠完全吸附于壁上后，小心吸去上清；再加入上述缓冲液，重复洗1次；
8)加入含dmp的交联缓冲液重悬磁珠，并振荡充分混合后，将ep管搅拌条件下室温静置45min；
10)加入封闭缓冲液(ph8.2,0.1m乙醇胺)，振荡充分混合，将ep管放入磁铁中，静置，待磁珠完全吸附于ep管壁后，吸去上清；
12)将ep管放入磁铁中，静置，待磁珠完全吸附于ep管壁后，小心吸去上清，加入pbs缓冲液，振荡充分混合，将ep管放入磁铁中，静置，待磁珠完全吸附于ep管壁后，吸去上清，重复洗涤2次。
优选地，所述的活化培养基中，il-2的使用剂量为50-5000u/ml；所述的增殖培养基中，il-2的使用剂量为50-5000u/ml。更优选地，所述的活化培养基中，il-2的使用剂量为200u/ml；所述的增殖培养基中，il-2的使用剂量为200u/ml。
优选地，所述的活化培养基和增殖培养基中，基础培养基选自无血清细胞培养基或其它添加血清、血清替代物的细胞培养基。所述的细胞培养基包括但不限于无血清细胞培养基(如x-vivo系列造血细胞无血清培养基、kbm551淋巴细胞无血清培养基及t淋巴细胞无血清培养基)或其它添加血清、血清替代物(如pallultroserg)的细胞培养基(如各品牌的rpmi-1640淋巴细胞培养基等)。
优选地，所述的体外扩增培养体系中，血清或血清替代物的添加比例为1％-30％v/v(体积百分比)。例如可以是1％、2％、5％、10％v/v(体积百分比)。
更优选地，所述的活化培养基和增殖培养基中，基础培养基均为x-vivo系列造血细胞无血清培养基。
本发明的第二个目的是提供应用nk细胞体外扩增体系进行nk细胞体外扩增的培养方法。
3)使用由活化剂即固相化抗cd52和il-2的组合与基础培养基组成的活化培养基，5％co2，37℃培养48小时；
4)从第3天起，使用由增殖剂即il-2和基础培养基组成的增殖培养基进行培养，期间根据细胞生长状态用上述增殖培养基换液，培养至第14天，即可收获活化nk细胞。
基础培养基选自无血清细胞培养基或其它添加血清、血清替代物的细胞培养基。所述的细胞培养基包括但不限于无血清细胞培养基(如x-vivo系列造血细胞无血清培养基、kbm551淋巴细胞无血清培养基及t淋巴细胞无血清培养基)或其它添加血清、血清替代物(如pallultroserg)的细胞培养基(如各品牌的rpmi-1640淋巴细胞培养基等)。血清或血清替代物的添加比例为1％-30％v/v(体积百分比)。例如可以是1％、2％、5％、10％v/v(体积百分比)。
cd52为抗cd52包被磁珠，所述的抗cd52包被磁珠的使用剂量为1×105磁珠/ml-5×106磁珠/ml，优选剂量为4×105磁珠/ml。
基础培养基选自无血清细胞培养基或其它添加血清、血清替代物的细胞培养基。所述的细胞培养基包括但不限于无血清细胞培养基(如x-vivo系列造血细胞无血清培养基、kbm551淋巴细胞无血清培养基及t淋巴细胞无血清培养基)或其它添加血清、血清替代物(如pallultroserg)的细胞培养基(如各品牌的rpmi-1640淋巴细胞培养基等)。血清或血清替代物的添加比例为1％-30％v/v(体积百分比)。例如可以是1％、2％、5％、10％v/v(体积百分比)。
基础培养基选自无血清细胞培养基或其它添加血清、血清替代物的细胞培养基。所述的细胞培养基包括但不限于无血清细胞培养基(如x-vivo系列造血细胞无血清培养基、kbm551淋巴细胞无血清培养基及t淋巴细胞无血清培养基)或其它添加血清、血清替代物(如pallultroserg)的细胞培养基(如各品牌的rpmi-1640淋巴细胞培养基等)。血清或血清替代物的添加比例为1％-30％v/v(体积百分比)。例如可以是1％、2％、5％、10％v/v(体积百分比)。
所述的步骤2)-4)中的基础培养基均为x-vivo系列造血细胞无血清培养基。
1)本发明的培养基中含有固相化抗cd52，结合il-2的使用，可以高效地刺激nk细胞进入活化、增殖状态，从而较易获得大量活化的nk细胞。而且，培养过程中无滋养细胞的使用，所制备的nk细胞可用于临床研究与治疗。
2)本发明简化了nk细胞培养方法，且所用的nk细胞活化组分少，所用物力、人力少，明显降低了nk细胞制备的生产成本，尤其适用于大规模生产。
3)从本发明实施例3的结果可以看出，本发明的培养体系14天可使nk细胞的扩增倍率达1000倍以上。现有专利cn8.9的扩增效果为，14天细胞密度从1-2×106/ml扩增到2-4×109/ml，也扩增了1000倍左右，本发明的扩增培养体系虽然相比现有技术省略了很多组分，但是扩增效果没有受到影响，说明本发明的nk细胞培养体系带来了预料不到的技术效果。
图1为磁珠高倍显微镜(400×)下形态观察。a.蛋白g磁珠；b.anti-cd52包被蛋白g磁珠。
本发明公开了一种新的nk细胞体外扩增体系及培养方法。本说明书中所公开的任一技术特征或参数均是系列实施案例的描述，以帮助专业技术等相关人士理解本发明。对于本发明中相应参数的任何等效性修改或替换，除非有特别的说明，都应被包括在此发明内。
3.将ep管中加入100μlph7.4的pbs缓冲液，旋涡重悬。将该ep管置于磁铁中，静置30sec，使磁珠吸附于ep管磁铁一侧。吸去上清。加入pbs，重复洗涤3次。去上清。
6.将ep管放置于磁铁中，等磁珠完全吸附于磁铁一侧后，吸去上清。再加入pbs，重复洗涤3次。
7.加入1mlph8.2的0.2m三乙醇胺交联缓冲液于含100μl磁珠的ep管中，轻轻振荡混匀。将ep管置于磁铁中，静置30min，待管中磁珠完全吸附于壁上后，小心吸去上清。再加入上述缓冲液，重复洗1次。
8.加入1ml含25mmdmp的交联缓冲液重悬磁珠，并振荡充分混合后，将ep管搅拌条件下室温静置45min。
9.将ep管放入磁铁中，静置30min，待磁珠完全吸附于ep管壁后，吸去上清。
10.加入1ml封闭缓冲液(ph8.2,0.1m乙醇胺)，振荡充分混合。将ep管放入磁铁中，静置30min，待磁珠完全吸附于ep管壁后，吸去上清。
11.加入1ml封闭缓冲液，振荡充分混合。将ep管搅拌条件下室温静置1hr。
12.将ep管放入磁铁中，静置30min，待磁珠完全吸附于ep管壁后，小心吸去上清。加入1mlpbs缓冲液，振荡充分混合。将ep管放入磁铁中，静置30min，待磁珠完全吸附于ep管壁后，吸去上清。重复洗涤2次。
从图1中可见，蛋白g磁珠的大小均质性好。当其进行抗cd52包被后，仍保持较好的均质性。
1、pbmc细胞制备。采集健康志愿者外周血，肝素抗凝，用ficoll密度离心法分离人外周血单个核细胞(pbmc)。
3、根据细胞生长状态，每隔2-3天用含200u/ml的il-2和基础培养基(即lonzax-vivo15无血清培养基)组成的增殖培养基进行换液培养至第14天。
4、流式细胞仪检测。于细胞培养的第14天，收获细胞。离心、生理盐水洗涤。加入100μl的2.4g2封闭细胞表面fc受体，4℃，避光，20min。加入100μlfitc标记抗cd3抗体和pe标记的抗cd56抗体混合液，4℃，避光，30min。加入1ml生理盐水，洗涤，离心。去上清。加入200μl含1mmoledta生理盐水，重悬细胞。将细胞上流式仪(facsaria)分析。结果用flowjo软件分析。
5、结果见图2示。抗cd52免疫磁珠结合il-2可使nk细胞扩增后的比例达近40％，而在此培养体系中增加抗cd3后，细胞可侧重于向t细胞分化，nk细胞占比明显降低。
从图3中可见，pbmc细胞经抗cd52免疫磁珠/il-2激活，并经il-2扩增培养14天后，nk细胞发生明显增殖，显微镜下nk细胞聚团明显，形成较大的细胞集落。
在常规的nk细胞活化、扩增方法中，通常利用抗cd3抗体进行活化。在此实施例中，加入抗cd3的目的是验证其与抗cd52是否有协同效应。结果表明，此二抗体在本发明体系中不仅无明显协同效应，组合后的效果还不如抗cd52单独活化效果好。
1、分别采集2名健康志愿者(志愿者1、志愿者2)外周血，肝素抗凝，用ficoll密度离心法分离人外周血单个核细胞(pbmc)。
培养方法1，按照实施例2，将抗cd52和抗cd3预先进行包被，并结合il-2(200u/ml)活化，培养pbmc，诱导nk细胞分化及扩增。
活化培养基由活化剂和基础培养基(即lonzax-vivo15无血清培养基)组成，活化剂为固相化抗cd52和il-2的组合；cd52为实施例1制备的抗cd52包被磁珠，使用剂量为4×105磁珠/ml培养基。il-2的使用剂量为200u/ml；
增殖培养基由增殖剂和基础培养基组成(即lonzax-vivo15无血清培养基)，增殖剂为il-2，il-2的使用剂量为200u/ml培养基。
使用由活化剂即固相化抗cd52和il-2的组合与基础培养基(即lonzax-vivo15无血清培养基)组成的活化培养基，5％co2，37℃培养48小时。
从第3天起，使用由增殖剂即il-2和基础培养基(即lonzax-vivo15无血清培养基)组成的增殖培养基进行培养，期间根据细胞生长状态用上述增殖培养基换液，培养至第14天，即可收获活化nk细胞。计数并流式分析cd3-cd56+nk细胞的扩增倍数。
结果：如图4所示，仅用抗cd52磁珠的培养体系和包被抗cd52/抗cd3培养体系对cd3-cd56+nk细胞的扩增效率相似，均可使nk细胞的扩增倍率达1000倍以上。二者间扩增效率无明显差别。
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