本发明提供了一种实现iNKT细胞快速扩增的方法，属于细胞生物学技术领域。该方法首先将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有α‑Galcer，麒麟菜多肽和IL‑2的培养液；之后将细胞置于37℃，5％CO2的细胞培养箱进行培养；之后每3天添加新的含有α‑Galcer，麒麟菜多肽和IL‑2的培养液，调整细胞浓度为2×106/mL；培养12‑14天后，收集细胞，纯化得到iNKT细胞。使用本发明方法获得的iNKT具有高增殖能力和高杀伤活性。
1.一种实现iNKT细胞快速扩增的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有α‑Galcer，麒麟菜多肽和
(c)每3天添加新的含有α‑Galcer，麒麟菜多肽和IL‑2的培养液，调整细胞浓度为2×
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)和步骤(c)中，所述培养液中
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述麒麟菜多肽的制备方法包括如下步
(e)加入1/100倍量的胰蛋白酶，调节温度为37℃，调节PH值为7.5，酶解3h，得到麒麟菜
(f)将得到的麒麟菜溶液B在100℃加热10min，灭活蛋白酶，得到麒麟菜溶液C；
(g)将得到的麒麟菜溶液C置于高速离心机中，离心收集上清，得到麒麟菜溶液D；
4.一种具有高增殖能力和高杀伤活性的iNKT细胞，其特征在于，所述iNKT细胞的获取
(a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有100ng/mL的α‑Galcer，100‑
(c)每3天添加新的含有α‑Galcer，麒麟菜多肽和IL‑2的RPMI1640培养液，调整细胞浓
5.根据权利要求4所述的iNKT细胞，其特征在于，所述麒麟菜多肽由权利要求3所述的
6.一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞的增殖能力的培养基中的应用，其特征在于，
7.一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞的细胞因子分泌能力的培养基中的应用，其特
8.一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞直接杀伤活性的培养基中的应用，其特征在
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述麒麟菜多肽通过提高iNKT细胞中穿孔
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述iNKT细胞直接杀伤活性为对于白血
[0001]本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种实现iNKT细胞快速扩增的方法。
一类T淋巴细胞亚群，仅占外周血T淋巴细胞的0.1‑1％。它们同时表达T细胞受体(TCR)和天
然杀伤(NK)细胞标志性受体CD161，因此兼具T淋巴细胞和NK细胞的一些功能，可以视为连
[0003]iNKT细胞通过其半变量TCR可识别脂质抗原，当接触到这些抗原时，可快速激活并
大量分泌细胞因子，包括IFN‑γ等，从而激活和调控T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等效应
细胞的免疫应答。此外，活化的iNKT细胞还可直接通过释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒因子
来杀伤目标细胞，如肿瘤细胞。因此，iNKT细胞通过产生细胞因子和直接细胞毒作用，在机
体的抗肿瘤免疫应答、抗病毒感染、自身免疫调节等过程中发挥双重免疫调节作用。
[0004]然而，由于人体外周血中iNKT细胞含量非常低，因此采用现有的扩增方法难以快
速获得大量并且高活性的iNKT细胞制剂。这最终影响了iNKT细胞在临床肿瘤免疫治疗中的
疗效，导致抗肿瘤效果不理想。因此，解决iNKT细胞体外快速高效扩增是当前面临的核心技
[0005]本发明目的在于提供一种实现iNKT细胞快速扩增的方法，从而实现iNKT细胞的快
[0007]首先，本发明提供了一种实现iNKT细胞快速扩增的方法，所述方法包括如下步骤：
[0008](a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有α‑Galcer，麒麟菜多肽
[0010](c)每3天添加新的含有α‑Galcer，麒麟菜多肽和IL‑2的培养液，调整细胞浓度为2
[0019](e)加入1/100倍量的胰蛋白酶，调节温度为37℃，调节PH值为7.5，酶解3h，得到麒
[0020](f)将得到的麒麟菜溶液B在100℃加热10min，灭活蛋白酶，得到麒麟菜溶液C；
[0021](g)将得到的麒麟菜溶液C置于高速离心机中，离心收集上清，得到麒麟菜溶液D；
[0022](h)将麒麟菜溶液D使用5kDa超滤膜进行浓缩，收集滤过液；
[0024]其次，本发明提供了一种具有高增殖能力和高杀伤活性的iNKT细胞，所述iNKT细
[0025](a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有100ng/mL的α‑Galcer，
[0030]其次，本发明提供了一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞的增殖能力的培养基中
的应用，其特征在于，所述麒麟菜多肽由上述的麒麟菜多肽的制备方法制备得到。
[0031]优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100μg/mL。
[0032]优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100‑2500μg/mL。
[0034]其次，本发明提供了一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞的细胞因子分泌能力的
[0036]优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100μg/mL。
[0037]优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100‑2500μg/mL。
[0039]其次，本发明提供了一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞直接杀伤活性的培养基
[0040]优选地，所述麒麟菜多肽通过提高iNKT细胞中穿孔素和颗粒酶B的基因表达来提
[0041]优选地，所述iNKT细胞直接杀伤活性为对于白血病细胞的直接杀伤活性。
[0042]优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100μg/mL。
[0043]优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100‑2500μg/mL。
[0046]本发明发现采用本发明所制备的麒麟菜多肽处理后，能够显著提高iNKT细胞的增
殖能力，并且能够显著提高iNKT细胞穿孔素和颗粒酶B的表达水平，增强细胞的直接杀伤作
[0047]同时，使用本发明所制备的麒麟菜多肽处理后的iNKT细胞分泌的细胞因子IFN‑γ
[0048]而且，使用本发明所制备的麒麟菜多肽处理后的iNKT细胞对于白细胞细胞K562的
杀伤活性明显增强。因此本发明提供了一种使用天然植物提取物快速获得功能增强的iNKT
[0050]图2为不同培养方法获得的iNKT细胞A和C中颗粒酶B和穿孔素的表达差异；
[0051]图3为不同培养方法获得的iNKT细胞A和C分泌的IFN‑γ的差异；
[0052]图4为不同培养方法获得的iNKT细胞A和C对于白血病细胞的杀伤活性差异。
[0055](b)按照1:1的将PBS加入到剩余的细胞中，吹打混匀之后，使用滴管缓慢的将其加
[0056](c)室温下2000r/min离心20min后，使用滴管小心吸取上、中层间的单核细胞并转
(e)洗涤细胞2次，加入含10％FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度为2×10mL，得
[0061](b)将洗净的麒麟菜切成细丝，放入烘干器中在50℃下烘干，烘干至恒重；
[0062](c)将烘干后的麒麟菜使用研磨机粉碎，并过筛得到麒麟菜粉末；
[0064](e)加入1/100倍量的胰蛋白酶，调节温度为37℃，调节PH值为7.5，酶解3h，得到麒
[0065](f)将得到的麒麟菜溶液B在100℃加热10min，灭活蛋白酶，得到麒麟菜溶液C；
[0066](g)将得到的麒麟菜溶液C置于高速离心机中，10000rpm离心30min，收集上清，得
[0067](h)将麒麟菜溶液D使用5kDa超滤膜进行浓缩，收集滤过液；
[0068](i)将滤过液放入冷冻干燥机中进行快速冷冻干燥后，得到麒麟菜多肽。
[0086](a)收集实施例3‑6培养9d的细胞，300g离心后，使用PBS进行洗涤；
[0091](f)采用LS柱再次进行磁珠分选，得到实施例3‑6培养的iNKT细胞，分别命名为
(a)将得到iNKT细胞A‑D按照2×10/mL的密度接种到96孔细胞培养板中，每个孔
[0094](b)每种细胞设置3个复孔，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO的细胞培养箱中
[0096]从图1的结果中可以看出，相较于iNKT细胞A，iNKT细胞B的细胞增殖率为142.7±
[0097]从上述结果可以看出，iNKT细胞B相较于iNKT细胞A提高了42.7％，增殖提高效果
显著，说明在培养基中添加100μg/mL的麒麟菜多肽便可以显著的提高iNKT细胞的增殖能
102.1％，说明在培养基中添加500μg/mL星空体育 星空体育平台的麒麟菜多肽可以更加显著的提高iNKT细胞的增
殖能力。但是，继续增加麒麟菜多肽的浓度，并没有进一步增加iNKT细胞的增殖能力。因此，
[0099]实施例9：检测iNKT细胞A和iNKT细胞C中穿孔素和颗粒酶B的基因表达水平
[0101](b)测定RNA的浓度和纯度合格后，使用Takara逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；
[0102](c)以GAPDH为内参，按照PCR反应体系添加试剂，进行PCR扩增反应；
[0103](c)琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物后，进行凝胶成像，结果如图2所示。
[0104]从图2可以看出，iNKT细胞C中的穿孔素和颗粒酶B基因表达水平明显高于iNKT细
胞A，说明使用本发明所制备的麒麟菜多肽处理iNKT细胞后可以有效的提高iNKT细胞中穿
(a)将得到iNKT细胞A和iNKT细胞C按照2×10/mL的密度接种到96孔细胞培养板
[0107](b)每种细胞设置3个复孔，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO的细胞培养箱中
[0108](c)培养72h后，离心收集上清，使用IFN‑γ的ELISA试剂盒检测上清中的IFN‑γ的
[0109]从图3可以看出，在未使用靶细胞刺激的情况下，iNKT细胞A分泌的IFN‑γ含量为
麒麟菜多肽处理iNKT细胞后可以有效的促进iNKT细胞分泌细胞因子IFN‑γ，来进一步激活
[0113](c)将混合后的细胞接种于6孔培养板中，同时设置靶细胞自然组(LDH释放量为0)
[0114](d)将细胞培养板置于37℃，5％CO的细胞培养箱中，培养6h；
[0115](e)培养结束后，离心收集上清，使用LDH检测LDH释星空体育 星空体育平台放量，计算各效靶比的iNKT细
[0120]上述的结果说明，使用本发明所制备的麒麟菜多肽处理iNKT细胞后可以有效的提
高iNKT细胞对于白血病细胞的杀伤作用，尤其在高效靶比(20:1)下，麒麟菜多肽处理组
iNKT细胞C的杀伤率高达91.86％，而对照组iNKT细胞A的杀伤率也只有63.61％，差异非常
[0122](a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有100ng/mL的α‑Galcer，
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