1.一种从细胞收获病毒的方法，其包括通过以下方式进行细胞裂解：使感染病毒的细
胞与收获液组合物接触；其中，所述收获液组合物包含：氯化钠、耐高盐核酸酶和氯化镁。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述病毒包括单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘‑带
状疱疹病毒、轮状病毒、肠病毒、肝炎病毒，或其任意组合；具体地，所述病毒包括单纯疱疹
3.如权利要求1所述的方法，其中，收获液组合物包含浓度为2.5‑4.5M的氯化钠。
4.如权利要求1所述的方法，其中，感染病毒的细胞与收获液组合物接触后形成的混合
体系包含浓度为500‑900mM的氯化钠；在一些具体实施方式中，感染病毒的细胞与收获液组
合物接触后形成的混合体系包含2‑5mM的氯化镁；在一些具体实施方式中，感染病毒的细胞
与收获液组合物接触后形成的混合体系包含浓度为5‑50U/mL的耐高盐核酸酶。
5.如权利要求1所述的方法，其中，细胞培养物与收获液组合物的混合体积比为10:1‑
6.如权利要求1所述的方法，其中，细胞培养物与收获液组合物的接触持续2‑6小时的
7.如权利要求1所述的方法，其中，细胞培养物与收获液组合物的接触在2‑35℃的温度
8.如权利要求1所述的方法，其中，收获液组合物通过以下星空体育网站 星空体育首页方式施用：向细胞培养物首
先添加氯化钠组分，然后添加耐高盐核酸酶组分和氯化镁组分；具体地，向细胞培养物首先
9.一种用于从细胞收获病毒的收获液组合物，其包含：氯化钠、耐高盐核酸酶和氯化
病毒类生物制品，包括溶瘤病毒药物、病毒类疫苗或重组病毒载体等，其制备过程
一般包括：将毒种接种于适宜代次细胞，当达到一定程度细胞病变时收获感染细胞，通过不
同的方式裂解细胞后收获病毒，然后通过密度梯度离心，过滤或层析方式纯化得到原液。
病毒位于胞内，因此收获病毒时希望有效地破碎细胞以释放病毒并且保证病毒颗粒的完整
性。不同的收获工艺对细胞裂解的效果及对病毒颗粒的完整性影响不同，可直接影响收获
单纯疱疹病毒(HSV)载体溶瘤病毒药物已成功获批。通常，HSV在感染细胞后会分
泌至胞外，但在实际收获时发现仍有部分病毒被包含在细胞中未得以完全释放。另外，分泌
至胞外的病毒中也有部分会黏附在细胞或细胞碎片上，从而未得以释放至培养液中，这部
分病毒可能会在后续纯化中损失。因此，破碎细胞释放胞内病毒以及使病毒从细胞或细胞
于小规模操作而言相对简单，但在放大时将受限于样品体积及低温设备，可操作性不强且
US10363304B2采用肝素来收获单纯疱疹病毒，但肝素因其潜在的动物源性而在临床应用方
面受限。中国专利CN104250639A提供一种无需低温设备且适于大规模生产的病毒收获方
法，该方法将收获液与可溶性盐混合以帮助释放病毒。但在实际操作中，采用该方法仍会有
经过长期探索研究，发明人发现了一种从细胞收获病毒的方法，其无需低温设备，
解：使感染病毒的细胞与收获液组合物接触；其中，所述收获液组合物包含：氯化钠、耐高盐
另一方面，本文提供一种用于从细胞收获病毒的收获液组合物，其包含：氯化钠、
申请中，“一”或其与各种量词的组合既包括单数含意也包括复数含意，除非特别说明。本申
请中，对于同一参数或变量，当给出多个数值、数值范围、或其组合予以说明时，相当于具体
揭示了这些数值、范围端值以及由它们任意组合而成的数值范围。本申请中，任一数值不论
是否带有“约”之类的修饰词，一律涵盖本领域技术人员能够理解的约略范围，例如正负
10％、5％等。本文中，每一“实施方式”均同等地指代且涵盖了本申请各项方法和各项系统
的实施方式。本申请中，任意实施方式中一项或多项技术特征可以与任何一个或多个其他
实施方式中的一项或多项技术特征自由组合，由此得到的实施方式同样属于本申请公开的
解：使感染病毒的细胞与收获液组合物接触；其中，所述收获液组合物包含：氯化钠、耐高盐
所述方法中，使感染病毒的细胞与收获液组合物接触(例如混合)，以形成混合体
本文中所用术语“细胞培养物”指的是其中含有细胞的细胞培养液。在一些实施方
任意两者为端点形成的范围内。在一些实施方式中，细胞培养物中的细胞密度在2.0×10
在一些示例性实施方式中，用于所述方法的病毒可包括：单纯疱疹病毒(HSV)、巨
细胞病毒、水痘‑带状疱疹病毒、轮状病毒、肠病毒(例如EV71、CA16等)、肝炎病毒(例如甲肝
病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等)，或其任意组合。在一些实施方式中，病毒可包括HSV病毒。在
在一些示例性实施方式中，用于所述方法的细胞可包括：人羊膜细胞、人胚肺成纤
维细胞、人肿瘤细胞(例如，子宫颈癌细胞、鼻咽上皮癌细胞、喉上皮癌细胞等)、非洲绿猴肾
如本文所用，术语“收获液组合物”是指用于释放胞内病毒或附着于细胞或细胞碎
在一些实施方式中，收获液组合物包含浓度为2.5‑4.5M，例如浓度在以2.5、3.0、
3.5、4.0、4.5M中任意二者为端点形成的范围内，优选2.5‑3.5M的氯化钠。
本文中所用术语“耐高盐核酸酶”或“SAN”指的是在高盐浓度下具有最佳酶活的核
在一些示例性的实施方式中，细胞培养物与收获液组合物的混合体积比为10:1‑
在一些示例性的实施方式中，细胞培养物与收获液组合物的接触(例如混合)持续
在一些示例性的实施式中，细胞培养物与收获液组合物的接触在2‑35℃，例如在
先添加氯化钠组分，然后添加耐高盐核酸酶组分和氯化镁组分。在一些示例性的实施方式
中，向细胞培养物首先添加氯化钠组分并持续接触(例如混合)0‑2小时，然后添加耐高盐核
在一些实施方式中，收获液组合物为水性组合物。在一些实施方式中，收获液组合
物包括pH缓冲体系。在一些实施方式中，所述pH缓冲体系为PB缓冲体系或Tris缓冲体系，优
选为PB缓冲体系。在一些实施方式中，收获液组合物包含浓度为10mM‑50mM的pH缓冲体系。
施方式中，病毒培养包括向细胞培养物接种病毒毒株，和孵育接种后的细胞培养物。在一些
实施方式中，细胞培养可采用例如细胞工厂、微载体或固定床等培养方式进行。在一些实施
方式中，当细胞培养物接种病毒毒株并孵育48小时后(例如，48‑72小时)进行细胞裂解。
在一些实施方式中，所述方法还可包括，在细胞裂解之后进行病毒收获。在一些实
施方式中，病毒收获包括对经裂解处理的细胞培养物进行离心(例如密度梯度离心)，过滤
在一些实施方式中，所述方法还可包括，在病毒收获之后进行病毒滴度测定。在一
另一方面，本文提供一种用于从细胞收获病毒的收获液组合物，其包含：氯化钠、
在一些实施方式中，收获液组合物包含浓度为2.5‑4.5M，例如浓度在以2.5、3.0、
3.5、4.0、4.5M中任意二者为端点形成的范围内，优选2.5‑3.5M的氯化钠。
浓度为2‑5mM，例如浓度在以2.0、2.5、3.0、3.5、40、4.5、5.0mM中任意二者为端点形成的范
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明
而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改
胞与HSV混合；产毒阶段：35℃培养48h后收获。培养液滴度为6.80E+07pfu/mL，体积为20mL。
工艺条件筛选：在小规模(20mL)体系中对氯化钠浓度、核酸酶浓度、温度和接触时
工艺验证与放大：在小规模(20mL)体系中对工艺进行验证。在CF10规模上对工艺
在本方案中，收获液组合物的用量为感染病毒后细胞培养基体积的1/4(v/v)。
HSV‑1病毒滴度的测定方法为空斑法。将Vero细胞培养至所需状态后进行铺板，然
后将不同稀释梯度的病毒样品进行感染，对感染后形成的空斑进行计数并计算HSV病毒滴
将从(1)中得到的培养液与收获液组合物(为PB缓冲体系；氯化钠浓度为2.5M，在
混合体系中的终浓度为500mM；SAN在混合体系中的终浓度为5U/mL；氯化镁在混合体系中的
终浓度为5mM)在35℃条件下混合2h后获得HSV病毒裂解液。测得裂解液滴度为7 .30E+
07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该实例收率为134.2％。
按照实例1的方法制备病毒裂解液，不同的是收获液组合物与培养液混合4h后获
得HSV病毒裂解液。测得裂解液滴度为8.90E+07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该实
按照实例1的方法制备病毒裂解液，不同的是收获液组合物与培养液混合6h后获
得HSV病毒裂解液。测得裂解液滴度为9.10E+07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该实
按照实例3的方法制备病毒裂解液，不同的是收获液组合物中SAN在混合体系中的
终浓度为25U/mL。测得裂解液滴度为9.05E+07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该实
按照实例1的方法制备病毒裂解液，不同的是收获液组合物中SAN在混合体系中的
终浓度为50U/mL。测得裂解液滴度为7.85E+07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该实
按照实例3的方法制备病毒裂解液，不同的是收获液组合物与培养液在24℃条件
下混合后获得HSV病毒裂解液。测得裂解液滴度为7.30E+07pfu/mL；以上清液为收率100％
按照实例3的方法制备病毒裂解液，不同的是收获液组合物中氯化钠浓度为3.5M，
在混合体系中的终浓度为700mM。测得裂解液滴度为7 .20E+07pfu/mL；以上清液为收率
按照实例3的方法制备病毒裂解液，不同的是收获液组合物中氯化钠浓度为4.5M，
在混合体系中的终浓度为900mM。测得裂解液滴度为5 .65E+07pfu/mL；以上清液为收率
将从(1)中得到的培养液与收获液组合物(为PB缓冲体系；氯化钠浓度为3.5M，在
混合体系中的终浓度为700mM；SAN在混合体系中的终浓度为5U/mL；氯化镁在混合体系中的
终浓度为5mM)在24℃条件下混合4h后获得HSV病毒裂解液。测得裂解液滴度为7 .750E+
07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该实例收率为142.5％。
将从(2)中得到的培养液与收获液组合物(为PB缓冲体系；氯化钠浓度为2.5M，在
混合体系中的终浓度为500mM；SAN在混合体系中的终浓度为20U/mL；氯化镁在混合体系中
的终浓度为5mM)在35℃条件下混合4h后获得HSV病毒裂解液。测得裂解液滴度为7 .30E+
07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该实例收率为182.5％。
将从(3)中得到的培养液与收获液组合物(为PB缓冲体系；氯化钠浓度为2.5M，在
混合体系中的终浓度为500mM；SAN在混合体系中的终浓度为20U/mL；氯化镁在混合体系中
的终浓度为5mM)在35℃条件下混合4h后获得HSV病毒裂解液。测得裂解液滴度为8 .35E+
07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该实例收率为244.5％。
按照实例9的方法制备病毒裂解液，不同的是收获液组合物中SAN在混合体系中的
终浓度为0U/mL。测得裂解液滴度为6.35E+07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该实例
将从(1)(2)中得到的培养液(20mL)分别于‑80℃条件下保存1h以上(至其完全冷
冻)，然后置于37℃恒温水浴锅中至完全融化，重复3次后获得HSV病毒裂解液。从(1)中获得
裂解液滴度为8.05E+07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该组收率为118.4％；从(2)
中获得裂解液滴度为6.10E+07pfu/mL；以上清液为收率100％计，算得该组收率为122.0％。
结果显示，通过本文所述的方法能够获得较高的病毒回收率。比较实例1‑3可知，
培养液与收获液组合物混合时间越长，裂解液滴度越高，混合时间达到4h左右样品基本裂
解完全。比较实例3和6可知，24℃和35℃条件下混合都能获得较高滴度的裂解液，因此本发
明所述裂解方法可在较高温度下进行，培养结束后无需降温可直接进行裂解。比较实例3、
实例7和实例8可知，收获液组合物中终浓度500‑700mM的氯化钠均能获得较高滴度的病毒
裂解液，但随着氯化钠浓度增高，病毒裂解液的滴度逐渐降低，当氯化钠浓度达到900mM时，
裂解液滴度显著降低。比较实例9与对照组1可知，添加SAN可显著增加裂解液的滴度和回收
率。比较实例10和实例11可知本发明所述方法在小规模(20mL)和放大规模(1L)都能获得
进一步实验显示，在低温(2‑8℃)和室温条件下进行HSV的收获均能够获得较好的
结果(数据未展示)，但在低温条件下进行HSV的收获时，需要先将培养液降温至目标温度，
融、超声、机械破碎、添加表面活性剂等其它细胞裂解方法或步骤。本文所述的病毒收获方
法具有操作简便、容易放大等优点，而且与本领域当前使用的方法相比病毒释放率显著提