实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR ，RT-qPCR) 是一种研究基因表达极为准确和灵敏的方法。在外源基因导入到靶细胞后，如何确定外源基因在靶细胞的表达情况呢？WB和RT-qPCR检测是非常好的选择。在前两期的干货中我们已经介绍了载体构建和质粒转染的基本操作，本期小恒将向大家详细介绍如何用RT-qPCR检测目的基因的表达水平。
RT-qPCR是一种对特定DNA进行定量分析的方法，其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行荧光定量PCR，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此对模板进行定量。
在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩星空体育登录入口 星空体育在线官网增和熔解曲线。那么首先我们来看几个基本概念：基线，荧光阈值和Ct值。
基线（baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线个循环的荧光值就是基线。
阈值（threshold）：阈值一般是基线倍，在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。
Ct 值（Ct value）：Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数，跟初始模板的量呈反比。
下面我们从荧光标记方法、详细实验步骤和常见问题分析三个方面来详细讲解RT-qPCR。
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的，其荧光标记方法分为两种：荧光染料嵌合法和荧光探针法。
荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料，该染料在游离状态下几乎不会产生荧光，可以非特异地结合在双链DNA的小沟区域，而不与单链结合。扩增的起始阶段，经过热变性双链DNA发生解链变成单链，染料结合不上去，没有荧光信号。随着反应的进行，有双链形成之后，染料就会与之结合，每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，产生较强的荧光信号，且信号强度与PCR产生的DNA总量成正比，所以荧光信号的强度能反映出体系中双链DNA的浓度。
染料法操作简单、灵敏度高且成本较低，被广泛地应用于科研中对目的基因定量分析和基因表达量的研究。但是SYBR Green I是一种非特异性荧光标记，如果反应体系中具有非特异性扩增和引物二聚体，也会被检测到荧光信号，从而对检测星空体育登录入口 星空体育在线官网结果产生影响。实验中我们通常需要设计特异性引物，来防止产生非特异性扩增。
那么在实验中如何判断是否有非特异性扩增呢?这里要引入一个概念——熔解曲线.溶解曲线和溶解温度示意图
在非杂交状态下，荧光基团与淬灭基团距离较近，当受到照射时，荧光报告基团通过FRET将能量转移到邻近的淬灭基团上，从而抑制荧光报告基团发射出荧光信号。进行PCR时，TaqMan探针可特异地复性杂交到 PCR 产物上。Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的 TaqMan探针，其 5→3外切酶活性将探针降解，使荧光报告基团与淬灭基团分开，破坏了 FRET，从而产生荧光信号，信号强度与PCR过程中扩增得到的靶DNA产物量成正比。因为只有靶序列与探针互补时荧光信号才会增加，所以不会检测到非特异扩增。
不同的荧光报告基团检测通道不同，因此可以通过不同通道的报告基团实现多重PCR，即在同一个反应体系中检测多个基因。而染料不能区分不同基因产物的荧光信号，因此一次只能检测一个基因。我们在实验中到底选择哪种方法呢？如果用于区别同源性高的序列，以及进行SNP分型解析等多重PCR检测，那么就只能用荧光探针法。而进行除此之外的RT-qPCR实验，都可以使用荧光染料法。
(1) 引物最好跨内含子设计（此原则下设计的引物将不受反转录试剂盒中是否含有gDNA Remover的影响）；
(1) 样品准备：贴壁细胞：6孔板取1个孔的细胞加入1ml Trizol，室温裂解10 min；悬浮细胞：离心沉淀细胞，每5-10×10^6个细胞加入1ml Trizol室温裂解10 min；组织：50-100mg新鲜组织装入1.5ml EP管放入液氮急冻，加入1ml Trizol冰上匀浆，室温裂解10 min。
(2) 两相分离：每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15 s后，15到30℃孵育2到3 min。4℃下12000 rpm离心15 min。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
②变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。2 kb处的28S和0.9 kb处的18S各有一条清晰明亮的条带，而在0.1kb处的5S有一条极淡的条带。长期以来人们使用28S：18S=2：1的比率作为鉴定完整RNA的标准。事实上，大多数样品中提取的RNA几乎达不到这一比值。若2 kb处的28S和0.9 kb处的18S条带明亮清晰且28S：18S1，则能满足绝大部分实验的要求。
【注】：逆转录温度推荐使用42℃ ，对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。反应时间推荐使用15min，长片段PCR需适当延长反应时间。不同试剂盒的反应体系和条件不同，需根据说明书介绍摸索最适条件。
通常使用两步法进行PCR扩增，即只有“变性”→“退火延展”两个温度变化。当使用Tm值较低的引物或者两步法扩增性能较差时，可以尝试三步法，即有“变性”→“退火”→“延伸”三个温度变化。两步法适用于扩增较短的目的片段，用时短。三步法则可以扩增较长的目的片段，用时较长。如果想得到更加严谨的数据，三步法更合适。
相对定量是检测实验组和对照组中靶基因的倍数差异，特别适合在对RNA模板的数量不能精确定量，或者只需要知道目的基因的表达差异时，另外，相对定量需要进行归一化处理。绝对定量
是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量；该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA；绝对定量特别适合在需要知道每毫升样品中的某基因的拷贝数时，另外，绝对定量需要校准。下面我们详细介绍相对定量的分析方法。
相对定量数据分析方法有双标曲线法(Livak法)，用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法，其中最常用的是2法(Livak法)，具体分析方法如下：
·引物设计需要优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现，根据引物设计原则重新设计引物；必要时可以设计多对引物做预实验，选取最优的用于后续实验；引物二聚体在熔解曲线℃左右。
·引物浓度过高：适当降低引物的浓度，引物的理想终浓度为200 nM，必要时可将浓度降低至60 nM。
·模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，必要时重新制备模板。
·扩增效率问题：对PCR产物进行电泳检测，观察是否有条带。若没有条带，需要排查引物、模板以及反应条件等问题。引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。
·模板量不足或者目的基因表达丰度过低：对未知浓度的样品应从最高浓度做起，通常所需cDNA量为1-100ng。如果目的基因表达丰度过低，那就需要更多的样本量。
·程序设置是否不当：一般SYBR Green I法采用72℃延伸时采集信号，Taqman法则在退火结束时或延伸结束采集信号。
·扩增效率低：反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
·仪器设置不当，比如说基线设置不当，阈值设置不当，参比染料设定不正确等。
·反应体系引起的：扩增效率过高或过低，模板的浓度太高或者降解。可以对目的基因做标准曲线评估反应效率。
·当扩增效率为100%时，斜率为-3.32，当斜率在-3.10 ~ -3.58范围内，即扩增效率为90% ~ 110%时，都属于正常范围。R2最佳值为1，一般大于0.98即可。
·不同公司的qPCR仪器适配的耗材和试剂可能不同，提前阅读仪器说明书或咨询仪器工程师、实验室人员等确认，仪器和耗材或试剂不兼容可能会导致结果偏差。
·qPCR板上不能做标记，极有可能影响荧光信号的采集，若担心加样有误可使用实验记录本协助记忆。