本发明涉及原代细胞的培养方法。将原代细胞培养在无血清培养基中，该无血清培养基包含一种因子，该因子选自由生长因子和粘附因子组成的组。该原代细胞的培养方法可以是病毒，例如痘病毒，扩增方法中的一个步骤。根据该后者的方法，将原代细胞培养在无血清培养基中，该无血清培养基包含一种因子，该因子选自由生长因子和粘附因子组成的组。细胞然后用病毒感染，并将感染的细胞在无血清培养基中培养，直到子代病毒产生。
大多数病毒疫苗，例如减毒或重组病毒，是由细胞培养系统制造的。用于病毒/疫苗生产的细胞可以是细胞系，即在体外连续生长的细胞，或者作为生物反应器中的单细胞悬液培养物，或者作为组织培养瓶或滚瓶的细胞支持物表面上的单细胞层。一些用于生产病毒的细胞系的例子是用于制造脊髓灰质炎病毒的人胎肺细胞系MRC-5，和用于制造麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒和风疹病毒(MMR II)的人胎肺细胞系WI-38(Merk SharpDohme)。
不但细胞系，而且原代动物细胞也用于制造疫苗。用于病毒生产的原代细胞的一个例子是鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)。这些细胞用于生产麻疹和日本脑炎病毒(Pasteur Merieux)、流行性腮腺炎病毒(由Provaccine制造)、狂犬病病毒(由Chiron Berhing GmbHCo.制造)、黄热病病毒(由Aprilvax制造)、流感病毒(由Wyeth Labs和SmithKlineBeecham制造)和改良的安卡拉牛痘病毒(MVA)。
CEF细胞经常被使用，因为许多病毒疫苗是通过在CEF细胞中连续传代以使毒性致病性病毒减毒而制成的。减毒的病毒不再致病，但仍能刺激针对病毒的毒性形式的强有力的保护性免疫。该类型病毒的一个例子是MVA。该病毒在人和大多数动物中被严格地复制受限。MVA正被开发成疫苗载体，因为它能用于表达源自在人中致病的各种介质的抗原。例如MVA的减毒病毒优选不在人细胞上繁殖，因为考虑到病毒在人来源的细胞中可能再次成为具有复制能力的。然而，已恢复在人细胞中复制能力的病毒如果投药给人可能会对健康造成危险，特别是如果个体是免疫受损的。出于这个原因，一些减毒的病毒，例如MVA，如果想要供人使用，则严格地从CEF细胞制造。
此外，CEF细胞被用于那些只在该细胞上生长的病毒。这样的病毒的例子特别是鸟类病毒如禽痘病毒，特别是金丝雀痘病毒、ALVAC、禽痘病毒和NYVAC。
在体外培养条件下生长的细胞系和原代细胞需要特殊的生长和维持的培养基，该培养基能支持(I)对数生长期中细胞的复制和(II)一旦细胞不再分裂，即当细胞处于稳定期时的细胞维持。一般使用的细胞培养基包含富含盐的溶液，该溶液含有维生素、氨基酸、必需微量元素和糖。支持细胞生长和维持所需的生长激素、酶和生物活性蛋白质通常以动物血液来源的血清产品的形式作为补充物加入到培养基中。动物血液来源的血清产品的例子是胎牛血清、小鸡血清、马血清和猪血清。这些血清源自分级分离的血液，在该血液中红细胞和白细胞已被除去。原代细胞，如CEF细胞，比细胞系甚至更依赖于动物血清来源。因此，原代细胞通常被培养在包含5-10％血清的细胞培养基，大多数情况为胎牛血清(FCS)中。
动物血清不仅包含细胞生长所需的因子，而且包含细胞所需的因子，这些细胞以贴壁细胞形式自然生长来附着于培养容器的细胞支持物表面。因此，对于贴壁细胞来说，将足够的血清加入到培养基中是关键性的，以使得它们生长并形成单细胞层。
令人遗憾的是，牛/胎牛血清以及来自其它动物的血清可能包含外来致病介质例如病毒。存在一种潜在的危险，即这些致病介质被传播给动物/人，该动物/人将要用细胞培养物产生的疫苗或任何其它药物产物治疗或接种。如果将细胞培养产物投药给免疫受损的人，则这是特别相关的。与一般使用的牛血清补充物相关的许多潜在的主要问题之一是，有可能将引起牛海绵状脑病(BSE)的介质传播给与细胞培养产生的产物进行接触的动物/人。
考虑到与在细胞培养中使用动物血清相关的可能危险，已经清楚，人们非常期待不使用动物产物的制造过程。
为了这一目的，不一定非要补充有动物血清的特殊培养基已分别为持续生长的细胞系和为在持续生长的细胞系中生产病毒而被加以开发。能被用来培养细胞系的这样的无血清培养基的一个例子是由Gibco BRL/LifeTechnologies制造的VP-SFM。根据制造商的信息，VP-SFM特别地为VERO、COS-7、MDBK、Hep2、BHK-21和其它重要细胞系的生长(Price，P.和Evege，E.Focus 1997，1967-69)和为在所述细胞系中病毒的生产而设计。得不到关于在该培养基中培养原代细胞的信息。
US 5,503,582公开了在包含4％小牛血清的培养基中培养CEF细胞、随后在无血清培养基中用禽痘病毒感染细胞。Spataro，A.C.et al.，J.Cell.Sci.1976；21，407-413公开了一旦形成单细胞层，CEF细胞能在无血清培养基中维持24小时。因此，根据这两件出版物，用于接种后培养细胞的培养基包含血清。只有用来维持已附着于表面和已达到稳定期的细胞，才使用无血清培养基。如果用常规培养基，例如培养基199或无血清的RPMI-1640接种，没有单细胞层形成，且细胞在培养基中形成不能生活的聚集物。
WO 98/15614提到用于体外培养动物细胞的一种特殊的无血清培养基。能在如WO 98/15614中公开的培养基中培养的细胞是动物来源的细胞，包括获自哺乳动物、鸟类、昆虫或鱼类的细胞。哺乳动物细胞可以是人类来源的原代细胞。没有涉及原代鸟类细胞。
US 5,405,772公开了用于细胞增殖和发育的无血清培养基。细胞优选为造血细胞和骨髓基质细胞。没有提及原代鸟类细胞。
WO 98/04680公开了用于依赖贴壁哺乳动物细胞，例如细胞系BHK、Vero或MRC-5的生长的无血清培养基。WO 98/04680既没有涉及原代细胞也没有涉及鸟类细胞。
发明目的本发明的目的是提供一种使得原代细胞得以培养的方法，所述原代细胞特别是在无血清培养基中的原代鸟类细胞，其中该方法使得(I)对数生长期中细胞得以生长和(II)在稳定期中细胞得以维持。此外，如果细胞是贴壁细胞，则培养基可以优选使得(III)贴壁细胞附着于细胞培养容器的表面。本发明的更进一步目的是提供通过在无血清条件下使用原代细胞生产病毒的方法。
发明的详细描述本发明提供培养原代细胞的方法，其特征在于将细胞培养在无血清培养基中，所述无血清培养基包含一种因子，所述因子选自由生长因子和粘附因子组成的组。
根据本发明，以贴壁细胞形式自然生长的原代细胞在接种后附着于细胞培养容器的表面，且在对数生长期中生长，直到形成单细胞层。根据本发明，静息细胞可被维持在细胞附着和对数生长期间所使用的培养基中。
本发明的方法不限于形成单细胞层的细胞。根据可供选择的另一实施方式，根据本发明的方法可被用于所有其它类型的原代细胞，例如在悬浮培养物中自然生长的细胞(例如淋巴细胞或其它类型的血细胞)或在自然状态下应该以贴壁细胞的形式生长但已适合在悬浮培养物中生长的细胞。
预料不到的是，以贴壁细胞的形式自然生长的原代细胞(I)能有效地附着于细胞培养容器的表面，而不形成不能接受的量的聚集物，和(II)能在无血清时在对数生长期生长，因为一般认为原代细胞依赖于血清中包含的大量不同因子和成分。此外，当在无血清培养基中培养时，贴壁细胞被认为形成不附着于细胞培养容器表面的不能生活的聚集物。因此，预料不到的是，为达到贴壁原代细胞的附着和生长，在无血清培养基中加入选自由生长因子和粘附因子中组成的组中的一种因子就足够了。此外，也是预料不到的是，原代细胞可用根据本发明的方法中所使用的培养基在悬浮培养物中生长。而且，令人惊讶的是，在包含选自由生长因子和粘附因子组成的组中的一种因子的无血清培养基中，原代鸟类细胞，例如鸡胚成纤维细胞(CEF)能被加以培养以附着于细胞培养容器的表面，而不形成无法接受的量的聚集物，因为已知鸟类细胞在不包含生长因子或粘附因子的无血清培养基中生长非常差，即，预料不到的是，通过在无血清培养基中加入选自生长因子和附着因子中的一种因子，原代鸟类细胞的不良生长特性可被显著改善。
本说明书中使用的术语“原代细胞”对于本领域技术人员来说是熟知的。不限于以下定义，术语“原代细胞”是指刚分离自动物或人的组织、器官或有机体的细胞，其中细胞不能持续地且无限期地复制和分裂。通常，原代细胞在细胞培养物中分裂少于100次，经常少于50次，经常少于25次。因此，原代细胞没有经历无限增殖化过程。原代细胞的例子是脐带血淋巴细胞和人或动物成纤维细胞。动物成纤维细胞的优选例子是鸟类成纤维细胞，最优选的是鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)。对于原代人成纤维细胞，一个优选的例子是人包皮成纤维细胞。
对于本领域的技术人员来说，如何分离原代细胞的方法是熟知的。一般地，原代细胞培养物直接来源于组织、器官或胚胎。组织、器官或胚胎经过蛋白酶处理而获得单个细胞。细胞然后按照根据本发明的方法在体外培养条件下培养。
更特别地，CEF细胞获自用蛋白酶消化的鸡胚。根据本发明，CEF细胞以附着于固体细胞支持物表面的贴壁细胞的形式生长得最好。这些细胞开始复制并建立单细胞层。如果CEF细胞(胚胎消化后)在体外用不含动物血清的标准培养基培养，则细胞偶尔会附着于固体细胞支持物表面，但不会复制以形成细胞的汇合单细胞层，且随时间会慢慢地从固体培养支持物表面分离。相反，如果CEF细胞根据本发明的方法加以培养，则细胞附着于固体支持物，在对数生长期中生长直到形成单细胞层，且能在稳定期中维持几天。
在关于贴壁原代细胞的上下文中，术语在无血清培养基中“培养细胞”是指在无血清培养基中将细胞接种到培养容器中，是指细胞在无血清培养基中在对数生长期生长直到形成单细胞层，和/或是指一旦形成单细胞层后在无血清培养基中维持细胞。更优选地，术语在无血清培养基中“培养细胞”是指一种方法，其中上面提到的所有步骤在无血清培养基中加以完成，以至于在整个细胞培养过程期间不出现任何动物血清产物。因此，在更一般的意思上，术语“在无血清培养基中培养细胞”是指导致单细胞层形成的所有培养基都是无血清培养基这一事实。所有上面步骤中使用的培养基可以包含选自生长因子和粘附因子中的一种因子。然而，仅仅将这样一种因子加入到用于细胞的附着和/或在对数生长条件下生长的培养基中可能就足够了。
在关于在悬浮培养物中生长的细胞的上下文中，术语在无血清培养基中“培养细胞”是指在无血清培养基中将细胞接种到培养容器中，细胞在无血清培养基中在对数生长期的生长，和/或一旦得到无进一步复制发生时的饱和密度，细胞在无血清培养基中维持。更优选地，术语在无血清培养基中“培养细胞”是指一种方法，其中用无血清培养基实施上面提到的所有步骤，以至于在整个细胞培养期间不出现任何动物血清产物。所有上面步骤中使用的培养基可以优选包含选自生长因子的组中的一种因子。然而，仅仅将这样一种因子加入到用于细胞接种和/或在细胞对数生长条件下生长的培养基中可能就足够了。正如下面所更详细地解释的，如果选择合适的孵育条件(例如通过运用“波浪”(wave)孵育)，通常以附着细胞的形式生长的细胞也有可能以悬浮培养细胞的形式培养。根据本发明的方法也适用于这种类型的孵育。
术语“无血清”培养基是指任何不包含动物或人来源的血清的细胞培养基。合适的细胞培养基对于本领域技术人员来说是已知的。这些培养基包含盐、维生素、缓冲液、能源、氨基酸和其它物质。适用于CEF细胞无血清培养的培养基的一个例子是培养基199(Morgan，Morton和Parker；.1950，73，1；和其它东西一起获自Life Technologies)。
根据本发明的方法使用的培养基，特别是用于贴壁细胞如CEF细胞的培养基，包含选自生长因子和粘附因子中的一种因子。粘附因子的一个例子是纤连蛋白。
然而，对于那些自然状态下以贴壁细胞的形式生长、然而却培养在悬浮培养物中(这是可能的，例如对于CEF细胞)的细胞来说，特别优选使用选自生长因子的组中的一种因子。对此类培养有用的生长因子的例子是重组牛、小鼠、小鸡或人表皮生长因子(EGF)。最优选的是重组人EGF(rh-EGF)(Chemicon Int.，目录号GF001)。
对于在悬浮培养物中自然生长的细胞，培养基可以优选包含选自包括EGF的生长因子的组中的一种因子。最优选地，用于此类细胞的生长因子是特异于非贴壁细胞的因子。那些生长因子的例子是白介素、GM-CSF、G-CSF和其它。本领域的技术人员可以通过常规实验容易地确定哪一类因子适合于哪一类细胞。
如果加入无血清培养基的因子是EGF，特别是rh-EGF，则优选以1-50ng/ml的浓度加入培养基，更优选5-20ng/ml。然而，本领域的技术人员将意识到这一事实，即为了获得最佳结果，不同的细胞类型可能在血清中需要稍微不同的EGF浓度。
如果加入无血清培养基的粘附因子是纤连蛋白(例如Chemicon Int.；人血浆纤连蛋白；目录号FC010)，则优选以1-50的浓度加入培养基，更优选1-10μg/cm2细胞培养容器表面。然而，本领域的技术人员将意识到这一事实，即为了获得最佳结果，不同的细胞类型可能在血清中需要稍微不同的EGF浓度。
根据本发明，仅将选自生长因子和粘附因子中的一种因子加入到培养基中就足够了，特别是如果细胞是贴壁细胞的话。然而，将选自生长因子和粘附因子中的两种或更多因子加入到培养基中也是可能的。培养基可以优选包含EGF和纤连蛋白，优选在上面所定义的浓度范围，特别是如果原代细胞是贴壁细胞如CEF细胞的话。
培养基可以进一步包含一种或更多添加物，该添加物选自微生物提取物、植物提取物和源自非哺乳类动物的提取物。微生物提取物优选为酵母提取物或酵母提取液(yeastolate)超滤液。植物提取物优选为水稻提取物或大豆提取物。源自非哺乳类动物的提取物优选为鱼类提取物。
根据本发明的一个优选实施方式，可将天冬酰胺加入到商业上可获得的无血清培养基中，该培养基已加入了选自生长因子和粘附因子中的一种因子。更优选地，将天冬酰胺加入到用病毒感染期间使用的培养基中(见下面)。商业上的无血清培养基通常包含0.3-1.0mM浓度范围的天冬酰胺。用来补充到培养基中的天冬酰胺的优选量为0.5-1.5mM的范围。最优选的是1mM天冬酰胺补充物。培养基中天冬酰胺的总浓度优选小于2mM，更优选为0.8-1.8mM范围。培养基中天冬酰胺的最优选浓度为1.3mM。
此外，谷氨酰胺可优选加入到培养基中。更优选地，将谷氨酰胺加入到用病毒感染期间使用的培养基中(见下面)。用于对培养基进行补充的谷氨酰胺的优选量在1-5mM范围，更优选在2-4mM范围。由于大多数商业性可获得的培养基不包含谷氨酰胺，所指示的范围也相当于培养基中的优选总浓度。
根据进一步的实施方式，本发明涉及一种扩增病毒的方法，包含以下步骤在第一步中，根据上述方法培养原代细胞，即，将原代细胞培养在无血清培养基中，该无血清培养基依据细胞类型包含选自由生长因子和粘附因子组成的组中的一种因子。根据本发明的这一实施方式，所有的条件、定义、优选的实施方式和对于培养上述原代细胞的方法的描述所给出的从优选到最优选实施方式的顺序，也适用于根据本发明的这一实施方式的病毒扩增方法的第一步的定义。在第二步中，原代细胞用病毒感染。在第三步中，感染的细胞在无血清培养基中孵育，直到子代病毒产生。
术语“病毒扩增”是用来解释，根据本发明的方法优选用来由于病毒在感染细胞中的生产性病毒复制而增加病毒数量。换句话说，输出病毒与输入病毒的比率应优选高于1。因此，根据本发明，针对特定病毒选择那些原代细胞，在这些原代细胞中病毒能生产性地复制。术语“繁殖性复制”是指这一的事实，即特定病毒在特定原代细胞中复制到产生感染性子代病毒的程度，其中输出病毒与输入病毒的比率高于1。
本领域的技术人员知道，哪些病毒能在哪类原代细胞中生产性地复制。举例来说，如果要扩增的病毒是人巨细胞病毒，则原代细胞可以是人包皮成纤维细胞；如果要扩增的病毒是麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、狂犬病病毒、日本脑炎病毒、黄热病病毒、流感病毒或痘病毒如牛痘病毒，特别是改良的安卡拉牛痘病毒(MVA)，则原代细胞可以是CEF细胞。
根据本实施方式的第二步感染原代细胞的方法对于本领域的技术人员来说是已知的。举例来说，可以简单地将病毒加入到培养基中。或者，可以除去培养基且可以将病毒加入到新鲜培养基中，随后将培养基加入到细胞中。为获得有效感染，病毒/培养基悬液的量应尽可能低，以获得高病毒浓度。病毒附着后，可以加入额外的培养基。
病毒扩增方法中第二步和第三步中使用的无血清培养基可以是前面已经使用的同一培养基，即依据细胞类型，包含选自生长因子和粘附因子中的一种因子的无血清培养基。然而，为节约成本，也可能在第二步和第三步中的一步或两步中使用这样的无血清培养基，该无血清培养基不含选自生长因子和粘附因子中的一种因子。
在所有阶段，可以用如上面概述的天冬酰胺和/或谷氨酰胺补充培养基，其中培养基中天冬酰胺的总浓度优选如上面所定义的。
根据优选的实施方式，扩增病毒的方法被用来扩增痘病毒。因此，根据这一优选的实施方式，本发明涉及扩增痘病毒的方法，包含以下步骤(I)根据上述方法培养原代细胞，即一种方法，其中将原代细胞培养在无血清培养基中，所述无血清培养基依据细胞类型包含选自由生长因子和粘附因子组成的组中的一种因子，(II)用痘病毒感染原代细胞，和(III)在无血清培养基中培养被感染的细胞直到产生子代病毒。
预料不到的是，痘病毒能在在无血清条件下培养的细胞上扩增，因为用已知的无血清培养基细胞生长得非常差。因此，预期在痘病毒显著扩增发生之前，与痘病毒感染相关的额外应激会杀死已经受应激的细胞。
术语“禽痘病毒”(avipoxvirus)是指任何禽痘病毒，如禽痘病毒、金丝雀痘病毒、Uncopoxvirus、八哥痘病毒、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑星空体育官方入口 星空体育官网痘病毒、孔雀痘病毒、企鹅痘病毒、麻雀痘病毒、椋鸟痘病毒和火鸡痘病毒。优选的禽痘病毒是金丝雀痘病毒和禽痘病毒。
金丝雀痘病毒的一个例子是Rentschler株。一种被称为ALVAC(US5,766,598)的噬菌斑纯化的金丝雀痘株根据布达佩斯条约的条件被保藏在美国典型培养物保藏机构(ATCC)，入藏号为VR-2547。另一种金丝雀痘株是叫做LF2 CEP 524 24 10 75的商业性金丝雀痘疫苗株，获自InstituteMerieux，Inc.。
术语“重组病毒”是指任何病毒，该病毒具有插入到病毒基因组中的异源基因，该异源基因在自然状态下不是病毒基因组的一部分。异源基因可以是治疗基因、编码包含至少一个诱导免疫应答的表位的肽的基因、反义表达盒或核酶基因。构建重组病毒的方法对于本领域的技术人员来说是已知的。最优选的痘病毒载体是MVA，特别是MVA575和MVA-BN(见上面)。
“减毒病毒”是一种病毒，其来源于致病性病毒，但相比于非减毒的亲本病毒其在对宿主有机体的感染上导致较低的死亡率和/或发病率。减毒痘病毒的例子对本领域的技术人员是已知的。减毒牛痘病毒的一个例子是MVA株，特别是已以保藏号V00083008保藏在ECACC的毒株(见上面)。
正如上面指出的，对于痘病毒，原代细胞可以优选为原代鸟类细胞，例如CEF细胞，或原代鸭胚成纤维细胞。同样，本领域的技术人员知道哪些原代细胞适合哪些痘病毒的扩增。CEF细胞特别优选用于MVA的扩增。对于CEF细胞中MVA的扩增，一个优选的实施方式是选择一种或两种选自EGF和纤连蛋白中的因子。
如果根据本发明的方法被用来在CEF细胞中扩增MVA，则优选培养基的起始pH在大约7.0至大约8.5的范围。特别优选的是起始pH为7.0。
本发明进一步涉及病毒，特别是通过上述方法获得的痘病毒。根据优选的实施方式，痘病毒是牛痘病毒，最优选的是MVA株，例如MVA-BN。
本发明进一步涉及包含病毒的组合物，特别是用根据本发明的方法生产的痘病毒。正如上面指出的，痘病毒优选为牛痘病毒，最优选为MVA株，例如MVA-BN。由于扩增病毒所使用的方法，该组合物不含任何动物血清中包含的产物和/或有传染性的介质。相反，包含根据常规方法生产的病毒的组合物包含源自动物血清的残余化合物。对于包含痘病毒，例如牛痘病毒株，特别是MVA株例如MVA-BN的组合物来说，尤其是这样。
本发明进一步涉及一种病毒，特别是如上面所定义的作为星空体育官方入口 星空体育官网药物或疫苗的病毒。如果病毒是野生型病毒或减毒病毒，则该病毒能被用于针对这样的病毒的接种。为此目的，特别优选减毒病毒。如果病毒是表达蛋白质的重组病毒，该蛋白质表达自对病毒基因组来说异源的基因，，则可能针对这样的病毒和/或针对所表达的异源蛋白质接种。如果重组病毒表达治疗性基因例如反义RNA或核酶，病毒可被用作药物。
本发明进一步涉及如上面所定义的病毒或如上面所定义的组合物用于制造疫苗的用途。
本发明进一步涉及一种对有需要的动物，包括人，进行治疗或接种的方法，包含将上面所定义的病毒或上面所定义的组合物投药给动物或人体。
实施例1鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备无特定病原体的(SPF)受精鸡蛋在4℃下贮存不超过12天。将鸡蛋放入培养箱中，并在37.8℃±8℃下孵育10-12天。每最多11个鸡蛋一个培养皿用10-20ml PBS制备。将鸡蛋放入专用的鸡蛋纸盒中，并用Bacillol广泛处理以对鸡蛋壳外部消毒。干燥后，在蛋上造洞，并小心地除去壳。储存尿囊绒膜以被用。拎起胚胎的脚以将其提起，然后将头砍去。然后将胚胎转移到准备好的培养皿中。除去脚后，躯干再次用PBS清洗。将最多11个躯干放入一个20ml的塑料注射器中并挤入锥形瓶中。每个躯干加入5ml预热的(37℃)胰蛋白酶/EDTA溶液，且溶液用磁搅拌器在室温下用无血清培养基搅拌15分钟。将胰蛋白酶消化的细胞通过一层筛眼注入烧杯中。将所有细胞转移到一个225ml离心管中，并在台式离心机中在20℃、470×g下离心7分钟以离心下来。在弃去上清液后，通过充分地上下移液，将沉淀重悬浮于1ml包含每个躯干10ng/ml EGF的刚刚预热的(37℃)无血清生长培养基中。加入刚刚预热的(37℃)包含10ng/ml EGF的无血清生长培养基至总体积为150ml。重复离心步骤。如上所述除去上清液并重悬沉淀。加入包含10ng/ml EGF的刚刚预热的(37℃)无血清生长培养基至总体积为100ml。如以下部分中描述地计数细胞。将所需数量的细胞接种在盛有包含10ng/ml EGF的无血清生长培养基的滚瓶中并在37℃下孵育。接种后第四天细胞可用于病毒感染。
实施例2计算细胞密度取细胞悬液的一个样品(见CEF制备部分)，并与1体积台盼蓝混合，致使最终细胞数为血细胞计数器的每16个小方格内20-100个细胞，该血细胞计数器由Fuchs-Rosenthal提供，名称为血细胞计数快速阅读102的(1∶2-1∶10稀释)。为了防止细胞重新聚合/沉降，重悬细胞后立即取样。用台盼蓝孵育几分钟以使染料完全进入死细胞后，将10μl细胞悬液加入到血细胞计数器中。只有白色的、活细胞才在光学显微镜下被计数，该光学显微镜使用10×物镜。总体上，计算3个具代表性的大方格，该大方格由3×16个小方格组成。从每个大方格中，只有呈L形的两个边界被包括在计数内。取计数细胞的平均数，且用以下公式计算最终细胞浓度平均细胞数目×稀释×104＝细胞/ml。最后将细胞悬液稀释至所需的工作浓度。
实施例3将选自生长因子和纤连蛋白中的一种因子加入到无血清培养基中对于CEF-单细胞层形成的影响在预先的试验中，发明人已显示了，如果使用不包含FCS的培养基199，则CEF细胞不附着于细胞培养容器的表面。而且，没有单细胞层形成。如果使用含有7％FCS的培养基199，则观察到正常的单细胞层形成。我们进行了分析，如果将添加物加入到培养基中，CEF细胞能否在无血清培养基199中附着和生长。
为了这一实验，将CEF细胞生长在培养基199中，其中单独添加或联合添加不同的添加物。在不含任何添加物的培养基199中生长的细胞用作阴性对照。在包含7％FCS的培养基199中培养的细胞用作阳性对照。所有实验在6孔细胞培养平板上用3ml培养基进行。在用于细胞培养之前，根据供应商的数据单处理添加物。让纤连蛋白在使用前吸附于细胞培养板表面上25分钟。纤连蛋白以3μg/cm2的浓度使用，而EGF以10ng/ml的浓度使用。在加入任何细胞之前，将细胞培养平板与含有纤连蛋白的培养基接触25分钟。
每种培养基加上要被测试的添加物都一式双份进行培养。将6孔细胞培养平板在37℃下孵育4天。从第1至第4天，用显微镜评价细胞的附着和生长。
对于阳性对照，观察到CEF细胞的正常附着和生长。对于不含添加物的培养基199，几乎不能观察到CEF细胞的附着。
相比于不含添加物的培养基199，通过使用加入到培养基199中的EGF，可以看到单细胞层形成中至关重要的改善。人们发现细胞附着并形成典型的成纤维细胞形态。此外，在整个4天期间能观察到连续生长。
通过将纤连蛋白加入到培养基中，也可达到细胞附着的改善。与仅添加EGF和仅添加纤连蛋白相比，EGF和纤连蛋白两者都添加导致轻微的改善。
总之，必须要作出结论说，通过使用添加物EGF和纤连蛋白，无血清培养基199中CEF细胞的单细胞层形成可以被支持。
此外，在平行实验中，将1×107CEF细胞接种在包含10％FCS的培养基、不包含FCS的培养基和不包含FCS但包含EGF的培养基中。接种后2天计算细胞数目。细胞数目分别达到用于接种的细胞数目的42％、6％和44％。因此，接种在包含EGS的无血清培养基中的细胞的结果与获得包含FCS的培养基的结果一样好，且显著好于既不含血清也不含EGF的培养基。
另外，包含EGF的培养基与各种标准无血清培养基进行比较，如DMEM、Opti-Mem或293-SFM。为这一目的，将1×107个CEF细胞接种在各种无血清培养基中，并培养4天。在包含EGF的培养基中培养的细胞的数目分别比在无血清DMEM、Opti-Mem和293-SFM中培养的细胞的数目高24倍、5倍和12倍。
实施例4用MVA感染CEF细胞接种在滚瓶中4天后对CEF细胞进行感染。在那个时间点，细胞已经生长成一个足够的单细胞层。用MOI为1或0.1的MVA感染细胞。为了进行感染，将生长培养基从烧瓶中除去。将所需量的每滚瓶病毒稀释在20ml的适当无血清感染培养基中。在这个阶段，无血清培养基可以或不可以包含选自生长因子和纤连蛋白的一种因子。将细胞在37℃在滚瓶培养箱中以0.3-0.5rpm与病毒一起孵育1小时。1小时后滚瓶用适当的无血清生长培养基填充至总体积为每个滚瓶200ml。在这个阶段，无血清培养基可以或不可以包含选自生长因子和纤连蛋白中的一种因子。在48或72小时后，通过将滚瓶冰冻至-20℃来停止病毒复制。
实施例5从感染的CEF细胞中制备病毒提取物和MVA的滴定将冰冻的滚瓶在室温下解冻。在解冻过程中，细胞从滚瓶表面上分离，且可通过摇动烧瓶机械地除去。收获病毒/细胞悬液并等分成较小的体积。为了从感染的细胞中释放病毒，将病毒/细胞悬液冷冻/解冻3次。冷冻/解冻的病毒样品用于滴定。
在96孔平板中在第1次传代的CEF细胞上进行滴定，使用10倍稀释的病毒悬液和每次稀释8次平行测定。在感染后，用抗牛痘病毒抗体和合适的染色溶液显现感染的细胞。
详细地说，在试验的第0天，将原代CEF细胞(见“鸡胚成纤维(CEF)细胞的制备”部分)用胰蛋白酶消化，且如“计算细胞密度”部分中描述的进行计数。用含7％FCS的RPMI培养基将细胞稀释至1×105细胞/ml。该稀释之后，用多道移液管在96孔平板的每个孔中接种100μl。细胞在37℃和5％CO2下孵育过夜。将要滴定的病毒样品(见“从感染的CEF细胞中制备病毒提取物”部分)用不含血清的RPMI从10-1至10-12以10倍的步骤连续稀释。这一连续稀释是通过将900μl RPMI加入到96孔深孔板的所有孔中而进行的。将100μl病毒样品加入到第一排的所有孔中并混合。其后，将100μl的每个样品用多道移液管转移到下一排孔中。当进行稀释时，将96孔深孔板放置在冰上。将平板在37℃和5％CO2下孵育5天以使得感染进行。5天后，用牛痘病毒特异性抗体将细胞进行免疫组织化学染色。为了进行染色，通过将96孔平板倒扣在容器上以除去培养基。用100μl/孔甲醇/丙酮(1∶1)混合物在室温下固定细胞10分钟。除去固定液并风干平板。干燥后，用PBS清洗细胞一次，并在室温下用抗牛痘病毒抗体(抗牛痘病毒抗体，兔多克隆，IgG组份(Quartett，柏林，德国#9503-2057))孵育1小时，该抗牛痘病毒抗体用含3％FCS的PBS稀释至1∶1000。除去抗体后，用PBS清洗细胞两次，并在室温下用HRP偶联的(辣根过氧化酶偶联的)抗兔抗体(抗兔IgG抗体，HRP偶联的山羊多克隆的(Promega，曼海姆，德国#W4011))孵育1小时，该HRP偶联的抗兔抗体用含3％FCS的PBS稀释至1∶1000。再次用PBS清洗细胞，并用邻联[二]茴香胺(o-Dianisidine)或TMB染色。对于使用邻联[二]茴香胺的染色方法，用100μl/孔染色溶液孵育细胞，该染色溶液由每60ml的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中含5mg邻联[二]茴香胺和180μl30％H2O2组成。在室温下孵育细胞直到它们染成褐色。1-3小时后，感染的细胞清晰可见。使用TMB染色方法时，用30μl/孔1.2mM TMB(Seramun Diagnostica GmbH)孵育细胞。孵育15分钟后，除去TMB溶液并用PBS清洗细胞一次。感染的细胞呈现暗蓝色。计数平板上感染的细胞。用Spearman和Kaerber公式计算病毒效价。计算TCID50时，将每个显示褐色或蓝色细胞的孔标记为阳性。因为试验参数保持恒定，故使用以下简化公式病毒效价[TCID50/ml]＝10[a+1.5+xa/8+xb/8+xc/8]a＝最后一列的稀释因子，其中所有8个孔都是阳性Xa＝在第a+1列中阳性孔的数目Xb＝在第a+2列中阳性孔的数目Xc＝在第a+3列中阳性孔的数目实施例6在无血清培养基中CEF细胞的最佳接种密度和感染CEF细胞的最佳MVA数量对于无血清CEF生长，测定了最佳的接种细胞密度为7.5×107细胞/850cm2(一个滚瓶的表面)。在接种后第4天细胞能够建立一个好的单细胞层而不形成大的团块，且可在该时间点被感染。
进行试验，以测定对于从无血清方法培养的CEF细胞中最大量生产MVA，病毒接种的最好水平和感染的长短。根据本发明，在培养基中以7.5×107细胞/850cm2的密度接种CEF细胞。接种后第4天，用不同数量的MVA感染细胞，MVA的范围为0.05至1.0TCID50/细胞。最好的结果获自0.1TCID50/细胞的MVA。
实施例7培养和用MVA感染的无血清培养基的最佳pHMVA和其它痘病毒感染对低于7.0的pH是敏感的。痘病毒在酸性pH时不稳定，，建议将纯化的痘病毒贮存在pH高于7.0的缓冲液中以保证在作为液体病毒制剂贮存时的稳定性和病毒完整性。进行试验以测定在不同的起始pH下进行感染时对病毒产量的影响。以通常方法将CEF细胞接种在含无血清培养基的滚瓶中，该无血清培养基包含10ng/ml EGF加4mM L-谷氨酰胺，并培养4天。用MVA以0.1TCID50/细胞在无血清培养基中在不同pH下感染细胞，该无血清培养基包含10ng/ml EGF加L-谷氨酰胺和1mM天冬酰胺，该不同pH范围为6.5至9.0。在感染后72小时，测定培养基的pH，并通过用通常方式滴定细胞提取物而测定病毒的产量。结果呈现在下表中，其显示了在感染开始时培养基的初始pH对病毒产量的影响。
对于在包含10ng/ml EGF、并补充有L-谷氨酰胺和天冬酰胺的无血清培养基中进行的感染，在起始pH从7.0至8.5时病毒生产是相对恒定的，但在起始pH为6.5和9.0时病毒生产是低的。在起始pH为7.0时获得了最佳产量。商业上可获得的标准无血清培养基通常具有7.4的pH值。因此将无血清培养基的pH调节至7.0能帮助改善病毒产量。
实施例8加入天冬酰胺对无血清培养基的影响预先的实验已经显示了，在培养CEF细胞和用MVA感染CEF细胞期间，天冬酰胺的量可以是受限制的。为克服天冬酰胺在培养和感染过程中在无血清培养基中的耗尽，将额外的天冬酰胺在感染CEF细胞之前以补充物的形式加入到培养基中。为测定用来补充培养基的天冬酰胺的最佳量，用无血清培养基中的CEF细胞(7.5×107细胞/850cm2)接种滚瓶，该无血清培养基包含10ng/ml EGF加4mM L-谷氨酰胺。接种后4天，用无血清培养基中的MVA，以0.1TCID50/细胞感染细胞，该无血清培养基包含10ng/mlEGF加4mM L-谷氨酰胺，并用不同天冬酰胺浓度加以补充(0.5，1.0和1.5mM)。在感染后72小时停止病毒复制，并测定病毒效价。结果示于下表中，下表显示了CEF细胞中MVA的生产，该CEF细胞为感染阶段补充有不同水平的天冬酰胺。效价代表每种天冬酰胺补充物的3滚瓶的均值。
结果证明，用天冬酰胺补充包含10ng/ml EGF的无血清培养基能改善病毒的生产，并且为感染过程而补充至1mM是最佳的。
1.培养原代鸟类细胞的方法，其特征在于将细胞培养在无血清培养基中，所述无血清培养基包含选自由生长因子和粘附因子组成的组中的一种因子。
3.根据权利要求1至2中任一项的方法，其中生长因子是表皮生长因子(EGF)，特别是重组人EGF。
4.根据权利要求3的方法，其中EGF的浓度在5-20ng/ml培养基的范围内。
6.根据权利要求5的方法，其中纤连蛋白的浓度在1-10μg/cm2细胞培养容器表面的范围内。
7.根据权利要求1至2中任一项的方法，其中培养基包含选自生长因子和粘附因子中的两种或更多种因子。
8.根据权利要求7的方法，其中培养基包含在如权利要求4和6中所定义的浓度范围内的EGF和纤连蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中培养基进一步包含一种或更多添加物，该添加物选自微生物提取物、植物提取物和来自非哺乳类动物的提取物。
10.根据权利要求9的方法，其中微生物提取物是酵母提取物或酵母提取液超滤液。
13.扩增病毒的方法，包含以下步骤(i)根据权利要求1至12中任一项所定义的方法培养原代鸟类细胞(ii)用病毒感染原代鸟类细胞(iii)在无血清培养基中培养感染的细胞直到子代病毒产生，其中原代鸟类细胞是允许所述病毒生产性复制的细胞。
14.根据权利要求13的方法，其中原代鸟类细胞是鸡胚成纤维细胞(CEF)。
15.根据权利要求13至14中任一项的方法，其中病毒选自流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、日本脑炎病毒、黄热病病毒、流感病毒和痘病毒。
19.根据权利要求15至18中任一项的方法，其中痘病毒是减毒病毒或重组病毒。
20.根据权利要求13至19中任一项的方法，其中步骤(ii)和(iii)中的一个或两个步骤的无血清培养基缺少选自生长因子和粘附因子中的因子。
21.根据权利要求13至20中任一项的方法，其中继步骤(iii)之后进行一个或更多的纯化步骤。
24.作为药物或疫苗的根据权利要求22的痘病毒或根据权利要求23的组合物。
25.根据权利要求22的痘病毒或根据权利要求23的组合物用于制造疫苗的用途。
26.在其需要时治疗或接种动物，包括人，的方法，包含将如权利要求22中所定义的痘病毒或如权利要求23中所定义的组合物投药给动物或人。
本发明涉及一种用于培养原代细胞的方法。将原代细胞培养在无血清培养基中，该无血清培养基包含选自由生长因子和粘附因子组成的组中的一种因子。培养原代细胞的方法可以是扩增病毒如痘病毒的方法中的一个步骤。根据该后者方法，将原代细胞培养在无血清培养基中，该无血清培养基包含选自由生长因子和粘附因子组成的组中的一种因子。细胞然后用病毒感染，并将感染的细胞培养在无血清培养基中，直到子代病毒产生。
发明者英格马·拉思, 伊娃·费尔德, 卡尔·赫勒 申请人:巴法里安诺迪克有限公司
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